菊花RNAi载体构建与青蒿遗传再生体系的建立
【摘要】： 菊花(Dendranthema×morifolium)是多年生宿根草本植物,因其品种、花色和花型众多,具有很高的观赏价值,而备受大众喜爱和研究者的青睐。青蒿(Artemisia annua L.)是一年生草本植物,常作为菊花嫁接的优良砧木。DNA甲基化是表观遗传学的一种重要的修饰方式,在植物中普遍存在且发挥着重要的作用。RNAi(RNAi interference)是关闭特定基因的新技术,在植物功能基因组、植物育种、植物抗逆方面得到广泛应用。本研究以DNA甲基化修饰能影响植物的形态特征以及RNAi信号能够通过砧木传递作为研究基础。构建能够影响菊花但不影响青蒿MET1基因的RNAi载体,同时建立青蒿的遗传再生体系,为后续的遗传转化奠定了基础。研究主要结果如下:(1)靶基因序列克隆以菊花紫精灵为实验材料,克隆得到含有不同酶切位点、大小为273 bp的片段,经测序分析,同源性为97%。确定该序列即为紫精灵MET1基因的一部分。(2)菊花RNAi载体的构建将靶基因片段通过酶切-连接法,正反向插入载体DHpart27RNAi FADP1P4上,经特异性引物PCR扩增验证、酶切和测序,证实菊花MET1基因序列在载体构建中未发生突变,RNAi载体构建成功。通过冻融法成功将RNAi载体转入农杆菌GV3101中。(3)本研究取自种青蒿生长40天的幼嫩的叶片、叶柄为外植体,建立了叶片和叶柄的遗传再生体系。(1)叶片和叶柄最佳的消毒效果分别是:0.1%的升汞中浸泡8 mim和0.1%的升汞中浸泡10 mim。叶片和叶柄存活率分别达到92.1%和84.5%。(2)最佳愈伤诱导培养基实验结果表明,叶片和叶柄均在培养基配方为:MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D+3%蔗糖+0.7%琼脂粉的固体培养基上愈伤诱导最好,并且叶柄诱导率达到95.7%,远高于叶片的诱导率(78%)。(3)最佳分化培养基叶片在培养基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉的固体培养基上分化率最高达到95.3%。叶柄在培养基MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D+3%蔗糖+0.7%琼脂粉的固体培养基上能一次成苗,成苗率为11%。(4)最优生根培养基将分化出的青蒿幼苗在1/2MS+1.0 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉的培养基上生根,在转接后的第6天,有白色的根眼萌发,根生长快并且粗壮,生根率达到98.9%。21天后将生好根的青蒿,移栽到室外,成活率为90%。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
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