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第四章微生物的代谢调控与代谢ppt课件

花匠小妙招
2024-12-28 03:34

文档简介

第四章微生物的代谢调控与代谢工程第一节微生物代谢的自我调节第二节微生物的代谢调控第三节提高代谢产物产量的方法第四节代谢工程第一节微生物代谢的自我调节微生物代谢是受到高度调节的，如下事实可以说明 1）微生物生长在含单一有机化合物为能源的合成培养基中，所有大分子单体（如氨基酸）的合成速率同大分子（如蛋白质）的合成速率协调一致，不会浪费能量去合成那些他们用不着的东西。 2）任何一种单体的合成，如能从外源获得并能进入细胞内，单体的合成自动停止，参与这些单体生成的酶的合成也会停止； 3）微生物只有在有某些有机基质（如乳糖）存在时，才会合成异化这些基质的酶； 4）如存在两种有机基质，微生物会先合成那些能异化更易利用的基质的酶，待易利用的基质耗竭才开始诱导分解较难利用的基质的酶； 5）养分影响生长速率，从而相应改变细胞大分子的组成（如RNA含量）一、酶活性调节共价修饰变(别)构效应酶活性的调节方式缔合与解离竞争性抑制 1、共价修饰酶活性调节（酶活性调节（continued continued ）指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。化学基团：磷酸基、腺苷酰基、甲基、乙基等蛋白质的共价结合部位一般为丝氨酸残基的-CH2OH 共价修饰分可逆和不可逆两种 1）可逆共价修饰有些酶存在活性和非活性两种状态，它们可以通过另一种酶的催化作用共价修饰而互相转换。如: 糖原磷酸化酶通过激酶和磷酸酯酶来调节活性磷酸化形式有活性去磷酸化形式无活性酶可逆共价修饰的意义： 1）因酶构型的转换是由酶催化的，故可在很短的时间内经信号启动，触发生成大量有活性的酶； 2）这种修饰作用可更易控制酶的活性以响应代谢环境的变化。这一系统具有能随时响应的特性，因而经常在活化与钝化状态之间来回变换。需消耗能量，但只占细胞整个能量消耗的一小部分变构调节机制： 1）变构酶具有一个以上的结合位点，除了结合底物的活性中心外，在同一分子内还有一些分立的效应物结合位点（副位点）； 2）主位点和副位点可同时被占据； 3）副位点可结合不同的效应物，产生不同的效应； 4）效应物在副位点上的结合可随后引起蛋白质分子构象的变化，从而影响酶活性中心的催化活性； 5）变构效应是反馈控制的理论基础，是调节代谢的有效方法。 3、缔合与解离酶活性调节（酶活性调节（continuedcontinued）能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成；蛋白质活化与钝化是通过亚基缔合与解离实现的； 4、竞争性抑制酶活性调节（酶活性调节（continuedcontinued）一些蛋白质的生物活性受代谢物的竞争性抑制如需要氧化性NAD+的反应可能被还原型 NADH的竞争抑制；需ATP的反应可能受 ADP或AMP的竞争型抑制；有些酶受反应过程产物的竞争性抑制二、酶合成的调节酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。凡是能促进酶合成的调节称为诱导；而能阻碍酶合成的调节称为阻遏。同调节酶的活性的反馈抑制等相比，通过调节酶的合成而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式；其优点是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。一）酶合成调节的类型诱导末端产物阻遏阻遏分解代谢产物阻遏 1、酶合成的诱导（induction）组成酶不依赖于酶底物或类似物的存在而合成如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶诱导酶依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成如大肠杆菌乳糖利用酶诱导剂可以是诱导酶的底物，也可是底物的结构类似物如：乳糖是大肠杆菌-半乳糖苷酶合成的诱导剂，也是此酶的底物实际上乳糖不是真正的诱导物，它必须先转化为别构乳糖才能起诱导剂的作用诱导剂也可以不是该酶的作用底物如异丙基- -D-硫代半乳糖苷（IPTG）是-半乳糖苷酶合成的极佳诱导剂，但不是作用底物；酶的作用底物不一定有诱导作用如对硝基苯-L-阿拉伯糖苷是-半乳糖苷酶的底物，但不能诱导该酶的合成。酶的诱导可分两种： 1）同时诱导当诱导物加入后，同时或几乎同时诱导几种酶的合成；主要存在于短的代谢途径中。如将乳糖加入到E.coli培养基后，可同时诱导出- 半乳糖苷透性酶、 -半乳糖苷酶、半乳糖苷转乙酰基酶；不管诱导强度如何，所以这三种蛋白以同一比例合成。（因为三者的基因组成同一操纵子） 2）顺序诱导先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。 2、酶合成的阻遏(repression) 末端产物阻遏 (end-product repression) 分解代谢物阻遏 (catabolite repression) 末端产物阻遏 (end-product repression) 1指由某代谢途径末端产物过量积累而引起的阻遏。 2对直线式途径来说，末端产物阻遏的情况较简单，即产物作用于代谢途径中的各种关键酶，使之合成受阻；对于分支代谢途径而言，情况较复杂，每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏（多价阻遏作用）。 3末端产物阻遏在代谢调节中有重要作用，保证细胞内各种物质维持适当的浓度；普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成途径中。分解代谢物阻遏 (catabolite repression) 是指两种碳源（或氮源）分解底物同时存在时，细胞利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关分解酶合成的现象。 or 当培养基中同时存在有多种可供利用的底物时，某些酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，这就是分解代谢阻遏。最典型的例子是细胞通过最易利用的碳源（如葡萄糖）的分解产物来抑制一些酶的合成。这个现象最早在青霉素的生产中发现，可快速利用的葡萄糖致使青霉素产量特别低，而缓慢利用的乳糖却能较好地生产青霉素。进一步的研究表明，乳糖并不是青霉素合成的特殊前体，它的价值仅在于缓慢利用。被快速利用的葡萄糖的分解产物阻遏了青霉素合成酶的合成。这种抑制青霉素合成及乳糖利用的现象，起初认为只有葡萄糖才会产生，故称为葡萄糖效应。把大肠杆菌培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基中，可明显看到大肠杆菌经历了两个对数期。葡萄糖在第一个周期中被利用。在葡萄糖代谢初期，-半乳糖苷酶和半乳糖苷透性酶的合成受阻遏，使乳糖不被利用。葡萄糖被消耗完后，乳糖代谢所需的酶开始合成，于是出现了利用乳糖的第二个生长周期。二）酶合成调节的分子机制目前认为，由Monod和Jacob提出的操纵子假说能较好地解释酶合成的诱导和阻遏启动基因(promoter) RNA聚合酶结合部位操纵子 (operon ) 操纵基因(operator) 操纵基因位于启动基因和结构基因之间，能与阻遏物（一种调节蛋白）相结合，以此来决定结构基因的转录能否进行结构基因(structural gene) 结构基因为一组功能相关的基因诱导型操纵子只有当存在诱导物时其转录水平才最高,并随之转译出诱导酶（inducible operon ）负责基质分解如乳糖操纵子阻遏型操纵子只有当缺乏辅阻遏物时其转录频率才最高，即只有通过去阻遏作用才能启动所编码酶的合成（repressible operon ）负责某些物质合成色氨酸操纵子末端产物(反馈)阻遏机制: (以色氨酸操纵子为例) 色氨酸操纵子的阻遏是对合成代谢酶类进行正调节的典例 E.coli色氨酸操纵子也由启动基因、操纵基因和结构基因（5 个）三部分组成。5个结构基因分别编码色氨酸合成途径中的5种酶。调节基因(trpR)远离操纵基因，编码阻遏物蛋白；其为由4个亚基组成的四聚体；单独的四聚体不能和操纵基因(trpO)结合，只有先结合了色氨酸分子后改变了四聚体的分子构象才能与trpO结合。当细胞内色氨酸浓度高时，色氨酸与阻遏物蛋白结合，形成完全阻遏物，与操纵基因结合，阻止结构基因转录（色氨酸为辅阻遏物）。当细胞内色氨酸缺乏或不足时，则导致阻遏物脱离操纵基因，使操纵基因“开关”打开，结构基因的转录又可正常进行。三、分支生物合成途径的调节 1、同工酶（isoenzyme）调节某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化，但这些酶受不同的终产物的反馈调节. (酶的分子结构不同) D E Y A B C F G Z 如：大肠杆菌的天门冬氨酸族氨基酸的合成途径中，有三个同工酶：天门冬氨酸激酶、，分别受赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的反馈调节 2、协同反馈调节(concerted feedback regulation) 需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果单个终产物过量，不产生或只产生很小的影响 E D A B C F G 3、累加反馈调节 (cumulative feedback regulation) 每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏，总的效果是累加的 30% E D A B C F 40% G 58% 4、增效反馈调节 (cooperative feedback regulation) 代谢途径中任一末端产物过量时，仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和。 15% E D A B C F 20% G 90% 5、顺序反馈调节 (sequential feedback regulation) 分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶，使分支点产物积累，结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一个酶，最后使整个代谢途径停止。 E F a b c d1 g1 A B C D G H I d2 g2 J K 6、联合激活或抑制调节由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢速率。肠细菌氨甲酰磷酸合成酶的联合激活和抑制抑制作用氨甲酰磷酸 N-乙酰谷氨酸谷氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸激活作用 CO2 氨甲酰磷酸合成酶 NH4+ 氨甲酰磷酸 UMP CTP 2ATP 抑制作用肠细菌中精氨酸和嘧啶核苷酸的合成途径是完全独立的，但它们有一共同的中间体氨甲酰磷酸。负责合成该中间体的酶氨甲酰磷酸合成酶可以被嘧啶代谢途径的代谢物UMP反馈抑制，也可被精氨酸合成途径中的中间体鸟氨酸激活。四、能荷调节能荷（energy charge）指细胞中ATP、ADP 、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。能荷调节指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动，也称腺苷酸调节。能荷不仅调节形成ATP的分解代谢酶类（如磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合成酶等）的活性，也调节利用ATP的生物合成酶类（如柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等）的活性。第二节微生物的代谢调控对于生命过程来说，代谢反应的协调是必要的；代谢反应的协调是通过细胞自身的代谢调控系统对细胞机能实行精细控制来达到的。但是，在工业生产中却往往需要单一地积累某种产品，这些产品的量又经常是大大地超出了细胞正常生长和代谢所需的范围。因此，要达到过量积累某种产品的目的，提高生产效率，就必须使原有的调节系统失去控制，在保证微生物适当生存的条件下，建立起新的代谢方式，使微生物的代谢产物按照人们的意志积累。一、克服反馈抑制和反馈阻遏的调控反馈抑制反馈调节反馈阻遏克服反馈调节，可从以下两方面着手：降低末端产物浓度应用抗反馈突变株 1、降低末端产物浓度 1）营养缺陷型的利用营养缺陷型是指原菌株因基因突变致使合成途径中断，丧失了合成某种必须物质的能力，而必须在培养基中加入相应物质才能正常生长的突变菌株。营养缺陷型突变株的代谢流受阻，末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈调节，可使代谢途径中的某一中间产物积累。利用营养缺陷型积累直链代谢途径中间代谢产物反馈抑制 Ea Eb Ec缺陷 Ed A B C x D E 反馈阻遏若要积累C，首先要获得缺失酶c 的营养缺陷型。酶c缺失后，物质C便不再转变成物质D，不再合成物质E。由于这种突变体已不能合成末端产物E，所以就解除了E对酶a和酶b 的反馈调节。但是，完全不能合成产物E的突变体，因为不能利用E去进一步合成必须的细胞物质，所以无法正常生长。为了保证突变体的正常生长，培养时须提供低浓度的、不足以引起反馈调节的物质E 。这样高浓度的中间产物C就能积累起来了。例如：利用枯草杆菌的精氨酸缺陷型生产瓜氨酸，利用大肠杆菌的赖氨酸缺陷型生产苏氨酸，都是这个道理。 2）提高细胞渗透性细胞内合成的发酵产物若要分泌到培养基中，必须经过细胞膜和细胞壁。如果产物不易分泌出细胞，而积累在细胞内，则会引起反馈调节。改变细胞膜和细胞壁的通透性，使其有利于产物的分泌，也是降低末端产物浓度的一种途径。降低末端产物浓度(continued) 2、抗反馈调节突变株的利用在以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径单一无分枝，往往不能选用营养缺陷型突变株。要提高产量，最好采用抗反馈调节突变株。抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。二、克服分解代谢阻遏的调控生产中要克服分解代谢阻遏可采取下列措施克服分解代谢阻遏的调控(continued 1、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源可采用相对来说不引起分解代谢阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有机酸和黄豆饼粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培养荧光假单胞菌，由于克服了半乳糖的分解代谢阻遏，结果在细胞中所产生的纤维素酶提高了1500倍。 2、流加碳源或氮源在考虑经济效益而必须使用有阻遏作用的碳源或氮源时，缓慢流加碳、氮源可使分解代谢产物维持在较低的水平上，而不至于产生阻遏。 3 、利用抗分解代谢阻遏的突变体如调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白失活，不能与末端分解代谢产物结合；或操纵基因发生突变使阻遏蛋白不能与其结合，都能获得抗分解代谢阻遏的突变株。第四节代谢工程一、代谢工程概述 1 1、代谢工程的基本定义、代谢工程的基本定义代谢工程(Metabolic Engineering) 利用生物学原理，系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。 2、代谢工程的基本过程 1）靶点设计至少包括三个基本过程首先，根据化学动力学和计量学原理定量测定网络中的代谢流分布（即代谢流分析; Metabolic flux analysis, MFA ），其中最重要的是细胞内碳和氮元素的流向比例关系。其次，在代谢流分析的基础上调查其控制状态、机制和影响因素（即代谢流控制分析；Metabolic flux control analysis, MCA）。最后，根据代谢流分布和控制的分析结果确定途径操作的合理靶点。通常包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或拟阻断途径的靶点等。 2) 基因操作利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作。其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控以及重组基因在目标细胞染色体DNA上的稳定整合。 3）效果分析一次性的代谢工程设计和操作往往不能达到实际生产所要求的产量、速率和浓度，因为大部分实验涉及的只是单一代谢途径有关的基因、操纵子或基因簇的改变。通过对新代谢进行全面的效果分析，这种由初步途径操作构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷，可以作为新一轮实验的改造目标。 3、代谢工程的基本原理代谢工程是多学科高度交叉的新型领域，涉及诸多基本原理： 1）涉及细胞物质代谢规律及途径组合的化学原理，它提供了生物体的基本代谢图谱和生化反应机制。 2）涉及细胞代谢流及其控制分析的化学计量学、分子反应动力学、热力学和控制学原理，这是代谢途径修饰的理论依据。 3）涉及途径代谢流推动力的酶学原理，包括酶反应动力学、别构抑制效应、修饰激活效应等。 4）涉及基因操作与控制的分子生物学和分子遗传学原理，它们阐明了基因表达的基本规律，同时也提供了基因操作的一整套技术。 5）涉及细胞生理状态平衡的细胞生理学原理，它为细胞代谢机能提供了一个全景式的描述，因此是一个代谢速率和生理状态表征研究的理想平台。 6）涉及发酵或细胞培育的工艺和工程控制的生化工程和化学工程原理，它为速率过程受限制的系统分析提供了独特的工具和经验。 7）涉及生物信息收集、分析与应用的基因组学、蛋白质组学原理，为代谢途径设计提供信息，是代谢工程技术迅猛发展和广泛应用的最大推动力。代谢网络分流处的代谢产物称为节点（Node）。节点其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。主节点不是固定不变的。 1、代谢网络结构组成代谢网络的组成取决于生物细胞的遗传性状及其所处的环境。代谢网络主要由3部分组成代谢网络组成的途径类型 A C H J E F G B D I K 收敛途径中心代谢途径发散途径指向中心代谢途径，并以中心代谢途径的中间化以中心代谢途径中间化合物为起点，并由中心代合物为接口的途径。谢途径向周围分散的途径 2、代谢网络结构的基本类型载流途径是代谢网络的组成部分，从某种水平上看，可以把载流途径的全部或局部看作一个亚网络。代谢网络和亚网络的结构可以抽象为两种基本类型：独立型和依赖型 1）相依型网络（依赖型网络）如果网络或亚网络中的每一节点都依照化学计量规则将代谢物转化为终端产物的组成部分，那么这样的网络或亚网络就是相依型网络。 S 1 2 P B1 各分支途径的代谢流均需达到化学计量平衡，保证除终端产物之外的代谢物不累积 S底物不分泌； P产物代谢网络中各主节点集中于产物； B1副产物网络各主节点的重要性相同。 2）独立型网络 S 若由主要节点流出的代谢物不能完全合成终端产物，即代谢网络的主节 1 点不集中，就属于独立型网络。 B1 2 B2 P 对于独立型网络，只要改变某一节 S底物点上的代谢物流量分配，就有可能提 P产物高终端产物的产率。 B1、B2副产物对于独立型网络而言，只要改变在某一节点上的代谢物流量分配，就有可能提高终端产物的产率。如图中节点1或2处的流量分配朝有利于产物P形成的方向改变，能在某种程度上提高其产但在相依型网络中，若要提高目标产物的转化率，这两个节点的流量分配则必须同时改变。 3、节点类型根据网络节点处代谢物流量的调控机制和特性节点分为：柔性节点（flexible node）刚性节点（rigid node）强刚性节点（strongly rigid node ）半柔性节点（Semiflexible node）弱刚性节点（weakly rigid node ） 1) 柔性节点流量分配容易改变并满足代谢需求的一类节点. S 柔性节点的主要特点是经受得起流量分配 N 的改变, 因此许多企图增加产物产率的代谢修饰均建立在主要节点为柔性的基础之上。 P1 P2 氨基酸生物合成途径中的许多分支节点均具有这种柔性, 这对于利用代谢工程技术改良生产菌的品质是非常重要的. 2) 刚性节点如果一个或多个途径的流量分割率受严格的控制，那么这类节点就称为刚性节点。刚性节点下游分支的比例（流量分配）是很难改变的，除非对其相关分支途径中的各种酶动力学特性进行全方位的修饰。代谢物P1和P2除了反馈抑制它们自身的合成外，在异构酶的作用下也对反向分支途径产生负调控作用。 3) 半柔性节点流量分配由某一分支途径的动力学控制的一类节点占主导地位的分支途径称为优势分支途径（如图中 NP2）; 催化优势分支反应的酶通常具有较高的活性，或者对节点代谢物呈现高亲和力，而且流向该分支反应的流量分配不受相应末端产物的反馈抑制调节。因此，即便从属分支途径是去调控的，其流量分割率也不受相应末端产物的反馈控制，绝大部分的节点流量仍将流入优势分支。半柔性节点在代谢途径中多见；这类节点的修饰也比较容易三、代谢工程的应用代谢工程的目的在于构建具有新的代谢途径，能生产特定目的产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，代谢工程的应用主要表现在以下三个方面：