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一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法

花匠小妙招
2024-12-28 21:53

一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法

本发明属于蔬菜作物遗传育种，涉及一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法。

背景技术：

1、芦笋(asparagus officinalis l.)，是百合科天门冬属的多年生草本植物，又称龙须菜、石刁柏，以新生嫩茎为食用部位，其嫩茎脆嫩爽口，营养丰富，被誉为“世界十大名菜之一”。芦笋富含蛋白质、矿物质、维生素、多糖、黄酮类物质以及人体所需要的多种氨基酸等营养成分，具有促消化、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等保健功能，食疗价值高(孙春艳，等.芦笋的化学成分及药理作用研究进展.中国野生植物资源，2004(05)：1-5)。

2、芦笋属于雌雄异株植物，通过种子繁殖，自然群体内遗传复杂，品种退化严重、繁育速度缓慢。目前我国芦笋优良品种种子主要依赖于国外进口，育种方面缺乏先进的繁育技术和创新品种。芦笋的性别为异型xy型决定方式，由位于性染色体(l5)上的一对等位基因m和m控制。开两性花的雄性基因型可被称作雄全株。两性花自交可以产生25％的“超雄株”(mm)，“超雄株”和雌性基因型(mm)之间杂交可产生f1代全为雄性杂合基因型(mm)的全雄品系。雄株不结籽，大量碳水化合物向下运输储存于鳞茎盘中，萌发的新笋直径比雌株大，所以产量一般比雌株高20～25％，且雄株在长势、寿命、抗病抗逆性等方面均优于雌株。全雄育种是芦笋育种工作的重要方向之一。通过传统的形态观察法鉴定自交后代性别受芦笋开花时期限制。因此，结合分子标记辅助育种对自交后代苗期进行性别鉴定，可帮助杂交制种亲本选择，加快育种速度，为芦笋全雄育种奠定基础。近年来，研究人员陆续开发与芦笋性别相关分子标记，但唯一共显性标记asp2-sp6在一些研究中的雌、雄dna池中不具有多态性，无法使用。因此，开发准确高效的性别标记对芦笋全雄品系育种与种子生产具有重要意义。

3、组织培养是通过无菌操作，将外植体接种于培养基上，在人工控制的营养和环境条件下进行培养，使其在较短的时间内快速再生出大量完整植株的方法。前人研究表明在相同的培养条件下，芦笋离体再生受基因型影响很大(孔萌萌，等.芦笋组织培养生根技术.上海师范大学学报(自然科学版)，2006(02)：91-94.)，目前国内通过器官发生途径先诱导外植体分化愈伤组织，再诱导不定芽和不定根，高效形成完整植株的研究鲜有报道。因此，建立芦笋愈伤组织诱导及其高效再生体系，可快速获得大量超雄株，为芦笋全雄育种工作提供大量重要种质材料，同时为芦笋遗传转化体系建立提供技术支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，以解决芦笋全雄育种年限长、现有性别分子标记品种适应性差、准确性较低、超雄亲本材料紧缺等产业实际问题。

2、本发明提供的技术方案是：一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，包括以下步骤：

3、步骤1、基因组dna提取：取不同性别类型的芦笋植株材料幼叶或嫩芽，采用改良的ctab法提取基因组dna；

4、步骤2、pcr扩增：以芦笋基因组dna为模板、使用共显性标记引物进行pcr扩增。pcr反应体系为10μl，即2×rapid taq master mix(vazyme biotech co.，ltd)5μl，ddh2o 3μl，引物f/r(10μm)各0.5μl，dna模板(20ng/μl)1μl。pcr扩增反应程序为：94℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；10℃保存。其中所述共显性标记asp-yy01的正向引物和反向引物序列如下：

5、asp-yy01f：5’-ggtatggagcttacattgatgca-3’

6、asp-yy01r：5’-ctagtgcatataggctgtgatgt-3’

7、asp-yy01引物对在超雄株中的扩增序列是长度为226bp的条带，具体序列如下：

8、

9、步骤3、凝胶电泳：利用6％聚丙烯酰氨凝胶(page)电泳进行pcr产物检测，凝胶清晰显影后拍照保存。具体操作步骤如下：

10、(1)制胶。将电泳玻璃板洗净、晾干，于玻璃板左右两侧放置胶条，边框处夹紧夹子，插入梳子调试松紧。配制acr：bis(29：1)凝胶混合液缓慢倒入胶板内，插入梳子，待凝胶混合液凝固备用。

11、(2)预电泳。取下夹子和胶条，将胶板安装进电泳槽内，在上下电泳槽内倒入1×tbe缓冲液，拔出梳子，90v电压下预电泳10min。

12、(3)电泳。点样1.2μl，120v恒压下电泳1.5h。

13、(4)固定与银染。拆下胶块平放于由纯水、冰乙酸、乙醇和硝酸银配制的固定银染液里，置于摇床上避光轻晃15min。

14、(5)显影。将固定银染液倒掉，清水清洗两次。倒入由纯水、甲醛和氢氧化钠配制的显色液中，放置在摇床上轻晃，至条带清晰为止。相机拍照保存。

15、步骤4、结果分析：普通雄株扩增出226bp和200bp两条条带，超雄株扩增出较长的一条条带(226bp)，雌株扩增出较短的一条条带(200bp)，性别检测结果应与田间花形态一致。

16、步骤5、外植体预处理：选取上述分子标记鉴定到的芦笋超雄株新生嫩茎作为外植体，用自来水冲洗5～10mim，然后剥去嫩茎上的鳞片，用超纯水冲洗干净后放入灭菌瓶；置于超净台用75％酒精浸泡35s，无菌水冲洗一遍，然后用0.5％次氯酸钠浸泡12～15min，最后无菌水冲洗3～4次，于无菌滤纸上晾干备用。

17、步骤6、愈伤组织诱导：用解剖刀将晾干后的嫩茎切成0.5～1.0cm长的茎段并纵剖成两半，接种于愈伤组织诱导培养基：ms+1.0mg/l 6-ba+0.75mg/l naa，30g/l蔗糖，8.0g/l琼脂，调节ph值5.8～6.0；接种后于温度25℃，光照16h/d，光照强度为20000lux的恒温培养室培养，进行初生愈伤组织诱导。培养25～30d后将外植体表面初生愈伤组织切下置于相同组分培养基上继代增殖2～3次，获得具有分化能力的愈伤组织。

18、步骤7、不定芽诱导：将上述生长状态良好的愈伤组织接种于愈伤分化培养基：ms+2.0mg/l 6-ba+0.05mg/l naa，30g/l蔗糖，8.0g/l琼脂，调节ph值为5.8～6.0；接种后于温度25℃，光照16h/d，光照强度为20000lux的恒温培养室培养，诱导愈伤组织产生芽点，进而分化出不定芽。

19、步骤8、不定根诱导：切取生长健壮的芽苗茎尖竖直接种于生根培养基：1/2ms+1.0mg/l iba+0.02mg/l kt+0.5g/l ac，30g/l蔗糖，8.0g/l琼脂，ph5.8～6.0；接种后于温度25℃，光照16h/d，光照强度为20000lux的恒温培养室培养，诱导不定根形成。接种后15～20d茎基部形成根原基，根系逐渐伸长变粗，40d左右形成完整的再生植株。

20、步骤9、炼苗移栽：待新生植株根系发达、茎叶生长状态良好时进行炼苗移栽。移栽前将组培瓶盖打开，加水没过培养基，于组培室内放置2～3d进行炼苗，用自来水洗净根部的培养基，移栽至基质培养，基质由草炭、蛭石和营养土构成，比例为3∶1∶1。

21、本发明提供的一种设施芦笋秸秆快速转化利用的方法，有益效果是：

22、(1)本发明提供的共显性分子标记准确性高、品种适应性广，可快速准确分离鉴定出芦笋超雄株、普通雄株和雌株。

23、(2)本发明提供的分子标记可广泛应用于苗期早期性别鉴定、两性株自交后代分离鉴定、全雄育种f1代纯度检测。

24、(3)本发明以超雄株芦笋嫩茎为外植体诱导出大量愈伤组织，可多代增殖扩繁，减少了材料季节性限制。

25、(4)本发明通过愈伤组织途径进行芦笋超雄株组培快繁，繁殖系数更高，结合分子标记早期性别鉴定，即可快速获得超雄株，为芦笋全雄育种提供重要种质材料。