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提高植物对草甘膦耐受性及生物量和产量的方法

花匠小妙招
2024-12-29 06:42

提高植物对草甘膦耐受性及生物量和产量的方法专利申请类型:发明专利;
源自:北京高价值专利检索信息库;

专利名称：提高植物对草甘膦耐受性及生物量和产量的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410593790.2

专利申请（专利权）人：中国农业科学院植物保护研究所
权利人地址：北京市海淀区圆明园西路2号

专利发明（设计）人：陈景超,李香菊,崔海兰,于海燕,李志玲

专利摘要：本发明涉及植物基因工程技术领域，提供一种提高植物对草甘膦耐受性及生物量和产量的方法，将可同时稳定高效表达抗草甘膦基因EPSPS和提高植物生物量及产量的基因PFK的表达载体导入植物，获得的转基因植物能够在对草甘膦产生高抗性的同时，还能提高植株的生物量及种子产量。本发明对于利用这两个基因转化植物协同表达培育抗草甘膦及高产植物及其应用具有重要意义，为培育新一代转基因抗除草剂作物提供新思路。

主权利要求：
1.基因EPSPS和基因PFK在提高植物对草甘膦耐受性和产量中的应用；
其中，基因EPSPS和基因PFK来自于牛筋草；
基因EPSPS为编码氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的蛋白质的基因；
基因PFK为编码氨基酸序列如SEQIDNO:4所示的蛋白质的基因；
所述植物为水稻或拟南芥。
2.表达载体，其特征在于，所述表达载体含有基因EPSPS和基因PFK，且基因EPSPS和基因PFK分别位于不同的表达盒中；
其中，基因EPSPS和基因PFK同权利要求1中所述的基因EPSPS和基因PFK。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，在所述基因EPSPS的5′端连有水稻EPSPS基因的叶绿体信号肽序列或拟南芥EPSPS基因的叶绿体信号肽。
4.根据权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于，基因EPSPS和基因PFK各自独立地由CaMV35S启动子或水稻泛素启动子驱动；
所述表达载体还包括终止子，所述终止子选自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子nosT或CaMV35S终止子T35S；
所述表达载体还包括增强子和/或内含子来增强目标基因的表达；
所述表达载体的出发载体为pCambia1301。
5.权利要求2‑4任一项所述表达载体在制备转基因植物中的应用；
所述植物为水稻或拟南芥。
6.根据权利要求5所述应用获得的转基因植物在植物育种中的应用；
育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖；
所述植物为水稻或拟南芥。
7.一种提高植物对草甘膦耐受性和产量的方法，其特征在于，将基因EPSPS和基因PFK构建到同一表达载体上，且基因EPSPS和基因PFK分别位于不同的表达盒中，然后将重组载体导入植物中；
所述植物为水稻或拟南芥。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述基因EPSPS的5′端连有水稻EPSPS基因的叶绿体信号肽序列。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，基因EPSPS和基因PFK各自独立地由CaMV35S启动子或水稻泛素启动子驱动；
所述表达载体还包括终止子，所述终止子选自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子nosT或CaMV35S终止子T35S；
所述表达载体还包括增强子和/或内含子来增强目标基因的表达；
所述表达载体的出发载体为pCambia1301。说明书 : 提高植物对草甘膦耐受性及生物量和产量的方法技术领域[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种提高植物对草甘膦耐受性及生物量和产量的方法。背景技术[0002] 杂草与作物竞争生长资源，传播病虫害，分泌有毒物质，影响机械收获，降低经济效益，是严重威胁作物产量和品质的一大类有害生物。然而，利用除草剂除草对农户的使用技术要求较高，部分除草剂在作物田防控杂草的选择性较强，对某一类杂草的防控效果较差。草甘膦等非选择性除草剂虽然杀草谱广，但是不能应用于大田作物或仅可以保护性喷雾，这限制了其应用。20世纪80年代以来，随着生物基因工程技术的迅猛发展使得通过转基因技术使农作物获得耐除草剂性状成为可能。1983年至今已经有多种耐除草剂转基因作物进行商业化种植，如玉米、大豆、棉花、油菜等，产生了巨大社会经济效益并在提高耕地利用效率、提高人工效率方面产生了巨大推动作用。目前绝大多数商业化的耐除草剂转基因作物主要靶标耐受性的除草剂为草甘膦。[0003] 草甘膦是一种非选择性、内吸传导型除草剂，由于具有杀草谱广、高效、环境友好等优点，现已成为世界上应用最广泛的除草剂品种。5‑烯醇式丙酮酸莽草酸‑3‑磷酸合成酶(EPSPS)是草甘膦的靶标酶。该酶是调控微生物和高等植物芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成的关键酶。EPSPS在莽草酸代谢途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与莽草酸‑3‑磷酸(S3P)缩合。草甘膦与PEP的空间结构相似，其作用机理就是通过与EPSPS和S3P形成稳定的复合体EPSPS‑S3P‑草甘膦，竞争性地抑制EPSPS的活性，阻断了莽草酸‑3‑磷酸转化为5‑烯醇式丙酮酸‑3‑磷酸莽草酸，使芳香族氨基酸化合物的形成受阻而导致生物体的死亡。[0004] 基因在植物体内过量表达会引起能量以及物质的大量消耗，在外界环境因素如土壤贫瘠等条件的影响下，可能导致作物正常生长受到较为严重的抑制。一些能量代谢调控基因的表达可以调节植物能量与物质代谢的平衡。因此将抗草甘膦基因与能量物质代谢调控基因在表达载体共同过表达，对于改善抗草甘膦转基因植物的生长状态及产量性状具有重要的作用。磷酸果糖激酶（PFK）是一种变构酶，是植物等生物体内调控糖酵解途径能量代谢的关键酶。该酶催化果糖‑6‑磷酸不可逆地转化为果糖‑1,6‑二磷酸。糖酵解途径产生的代谢产物磷酸烯醇式丙酮酸等物质是EPSPS蛋白的催化底物，PFK催化糖酵解途径也会产生能量，该酶对植物体内能量及糖类等物质的代谢起着十分重要的作用。发明内容[0005] 本发明的目的是提供一种同时稳定高效表达抗草甘膦基因EPSPS和提高植物生物量及产量的基因PFK的表达载体及其应用。[0006] 本发明的另一目的是提供一种提高植物对草甘膦耐受性及生物量和产量的方法。[0007] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供基因EPSPS和PFK在提高植物对草甘膦耐受性及生物量和产量中的应用。[0008] 本发明中，基因EPSPS和PFK来自于牛筋草（Eleusineindica）；[0009] 基因EPSPS为编码如下蛋白质（A）、（B）或（C）的基因：[0010] （A）由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或[0011] （B）SEQIDNO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（A）衍生的蛋白质；或[0012] （C）与（A）和（B）具有相同催化功能的从其他植物或微生物获得的氨基酸序列。[0013] 基因PFK为编码如下蛋白质（a）、（b）或（c）的基因：[0014] （a）由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或[0015] （b）SEQIDNO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（a）衍生的蛋白质；或[0016] （c）与（a）和（b）具有相同催化功能的从其他植物或微生物获得的氨基酸序列。[0017] 第二方面，本发明提供一种同时稳定高效表达抗草甘膦基因EPSPS和提高植物生物量及产量的基因PFK的表达载体，所述表达载体含有基因EPSPS和PFK，且基因EPSPS和PFK分别位于不同的表达盒中。[0018] 进一步地，在所述基因EPSPS的5′端连有水稻EPSPS基因的叶绿体信号肽序列或玉米EPSPS基因的叶绿体信号肽序列或拟南芥EPSPS基因的叶绿体信号肽。其中，水稻EPSPS基因的叶绿体信号肽序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。拟南芥EPSPS基因的叶绿体信号肽序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。[0019] 进一步地，基因EPSPS和PFK各自独立地由CaMV35S启动子、玉米泛素启动子或水稻泛素启动子等启动子驱动，优选CaMV35S启动子。所述CaMV35S启动子核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。[0020] 进一步地，所述表达载体还包括终止子，所述终止子选自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子nosT、CaMV35S终止子T35S等。所述根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子nosT，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。[0021] 进一步地，所述表达载体还包括增强子和/或内含子来增强目标基因的表达。如水稻actin基因的内含子等。[0022] 进一步地，所述表达载体的出发载体可以是pCambia系列载体(CAMBIA,Canberra,Australia)或者其它载体，优选pCambia1301载体。[0023] 第三方面，本发明提供所述表达载体在制备转基因植物中的应用。[0024] 第四方面，本发明提供根据所述应用获得的转基因植物在植物育种中的应用。[0025] 进一步地，育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。[0026] 第五方面，本发明提供一种提高植物对草甘膦耐受性及生物量和产量的方法，[0027] 将基因EPSPS和PFK构建到同一表达载体上，且基因EPSPS和PFK分别位于不同的表达盒中，然后将重组载体导入植物中；或，[0028] 将基因EPSPS和PFK分别构建到不同表达载体上，然后将含有基因EPSPS的表达载体以及含有基因PFK的表达载体共同导入植物中。[0029] 进一步地，在所述基因EPSPS的5′端连有水稻EPSPS基因的叶绿体信号肽序列或玉米EPSPS基因的叶绿体信号肽序列。其中，水稻EPSPS基因的叶绿体信号肽序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。[0030] 进一步地，基因EPSPS和PFK各自独立地由CaMV35S启动子、玉米泛素启动子或水稻泛素启动子等启动子驱动，优选CaMV35S启动子。所述CaMV35S启动子核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。[0031] 进一步地，所述表达载体还包括终止子，所述终止子选自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子nosT、CaMV35S终止子T35S等。所述根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子nosT，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。[0032] 进一步地，所述表达载体还包括增强子和/或内含子来增强目标基因的表达。如水稻actin基因的内含子等。[0033] 进一步地，所述表达载体的出发载体可以是pCambia系列载体(CAMBIA,Canberra,Australia)或者其它载体，优选pCambia1301载体。[0034] 本发明中，所述植物包括单子叶植物或双子叶植物。[0035] 所述单子叶植物包括玉米、水稻等。[0036] 所述双子叶植物包括大豆、油菜、棉花、拟南芥等。[0037] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：[0038] 本发明将抗草甘膦基因（EPSPS）和提高植物生物量及产量的基因（PFK）联合使用，获得的转基因植物既可以使用草甘膦除草，又可以提高植物的生物量及产量。本发明转化得到的植株可以为培育新一代转基因抗除草剂作物提供了新的资源，对于利用这两个基因转化植物协同表达培育抗草甘膦及高产植物及其应用具有重要意义。附图说明[0039] 图1为本发明较佳实施例中植物表达载体骨架示意图。[0040] 图2为本发明较佳实施例中筛选转基因水稻T1代种子。[0041] 图3为本发明较佳实施例中EPSPS与PFK基因的表达量检测。[0042] 图4为本发明较佳实施例中单、双价转基因水稻与野生型水稻生长后期生长状态。[0043] 图5为本发明较佳实施例中皿内培养情况下不同转基因拟南芥的对草甘膦（0、10μM）的耐受性情况。具体实施方式[0044] 本发明旨在提供一种同时稳定高效表达抗草甘膦基因EPSPS和提高植物生物量及产量的基因PFK的表达载体，及其在制备工程菌、抗除草剂植物细胞、农作物方面的应用，使转基因作物对草甘膦产生高水平抗性又能提高产量。[0045] 本发明采用如下技术方案：[0046] 本发明提供一种同时稳定高效表达抗草甘膦基因和提高生物量及产量的表达载体，所述表达载体含有抗草甘膦基因EPSPS和提高生物量和产量的基因PFK。[0047] 本发明所述抗草甘膦基因EPSPS编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；以及将SEQIDNO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有草甘膦抗性的蛋白质。[0048] 本发明所述提高植物生物量及产量的基因PFK编码的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。[0049] 本发明所述表达载体包含启动子，所述启动子包括CaMV35S启动子、玉米泛素启动子、水稻泛素启动子等，优选CaMV35S启动子。另外，还可以通过在使用增强子和内含子等原件来增强目标基因的表达，比如水稻actin基因的内含子。所述CaMV35S启动子核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。[0050] 本发明所述表达载体还包括终止子，终止子可以是来源于植物自身的终止子，也可以是来源于病毒和其它生物，或者人工合成的终止子。所述终止子包括根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子nosT(核苷酸序列如SEQIDNO:6所示)、CaMV35S终止子T35S。[0051] 进一步地，本发明所述表达载体还包括用于增强EPSPS基因表达的叶绿体信号肽序列，所述信号肽包括水稻EPSPS基因的叶绿体信号肽序列(核苷酸序列如SEQIDNO:7所示)或玉米EPSPS基因的叶绿体信号肽序列。[0052] 更进一步地，所述表达载体包含启动抗草甘膦基因EPSPS表达的玉米泛素启动子(ZmUbipromoter)pZmUbi，CaMV35S启动子等启动子中的一种，玉米EPSPS基因的叶绿体信号肽，水稻EPSPS基因的叶绿体信号肽中的一种，终止该基因表达的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子nosT；终止该基因表达的CaMV35S终止子T35S等终止子的一种。启动提高生物量及产量的基因PFK表达的玉米泛素启动子(ZmUbipromoter)pZmUbi，CaMV35S启动子等启动子中的一种，终止该基因表达的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子nosT；终止该基因表达的CaMV35S终止子T35S等终止子的一种。[0053] 本发明中用于提供表达载体骨架的基础载体可以是pCambia系列载体(CAMBIA,Canberra,Australia)或者其它载体，优选pCambia1301载体。[0054] 本发明还提供一种所述表达载体在制备转基因植物细胞中的应用，所述的应用是将所述的表达载体电击转化农杆菌EHA105，获得含有表达载体的农杆菌菌株，用农杆菌菌液侵染植物，获得含表达载体的植物细胞。[0055] 本发明还提供一种包含所述同时稳定高效表达抗草甘膦基因及提高植物生物量及产量基因的T‑DNA的植物细胞。[0056] 本发明同时还提供一种包含所述同时稳定高效表达抗草甘膦基因及提高植物生物量及产量基因的T‑DNA的转基因植物。[0057] 本发明构建的表达载体适于单子叶植物的表达或者双子叶植物的表达，单子叶植物包括玉米、水稻等；双子叶植物包括大豆、油菜、棉花、拟南芥等。[0058] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。[0059] 实施例1单、双价植物表达载体的构建[0060] 将水稻叶绿体信号肽序编码序列（OsCTP）与抗草甘膦基因EPSPS功能性的拼接在一起，标记为OsCTP‑EPSPS，人工合成OsCTP‑EPSPS并将合成的基因克隆于pUC57载体，所得到载体标记为pUC57‑OsCTP‑EPSPS。人工合成提高植物生物量和产量的基因PFK于pUC57载体，所得到载体标记为pUC57‑PFK。分别设计引物pUC57‑OsCTP‑EPSPS‑F: 5’‑ATGGCGGCGACCATGGCG，pUC57‑OsCTP‑EPSPS‑R:5’‑TTAGTTCTTGACGAAAGTGCTC；pUC57‑PFK‑F:5’‑ATGGCGCAGCCGCCGGCGTCCC,pUC57‑PFK‑R:5’‑TCACTTCTTGCCACTAGATTTG，采用Vazyme公司phantamaxsuper‑fidelityDNAPolymerase对pUC57‑OsCTP‑EPSPS和pUC57‑PFK进行PCR扩增（表1）。PCR反应程序为：95℃30s；95℃15s，退火温度45‑55℃15s，延伸72℃1min，39个循环；最后72℃延伸5min。[0061] 表1PCR反应体系（总体积50μl）[0062][0063] 根据表2体系，用BglII和BstEII双酶切载体pCambia1301‑KY（图1）使其线性化（采用Thermo公司相应限制性内切酶产品，载体购自上海进潮科技发展有限公司）。[0064] 表2酶切反应体系[0065][0066] 酶切产物纯化后与上述pUC57‑OsCTP‑EPSPS基因与PFK基因的PCR产物分别进行重组反应（重组反应试剂盒为Vazyme公司ClonExpress‑IIOneStepCloningKit）。[0067] 表3重组连接反应体系（总体积10μl）[0068][0069] 上述反应液使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。放置于37℃反应30min，随后立即置于冰上冷却。[0070] 重组产物转化大肠杆菌DH5α细胞。[0071] 转化步骤：[0072] （1）在100μl大肠杆菌感受态细胞中加入10μL连接产物；[0073] （2）冰浴30min；[0074] （3）42℃热激60‑90s；[0075] （4）冰浴2min；[0076] （5）加入800μlLB液体培养基；[0077] （6）37℃摇床培养30min；[0078] （7）6000rpm离心3min，弃上清，涂布Kana（50mg/L）抗性培养基平板；[0079] （8）37℃倒置培养12‑16h后，挑取抗性菌落；[0080] （9）在96孔板中，每孔加入100μLLB（含Kana）液体培养基；[0081] （10）各平板取4‑8个菌落，37℃，180rpm扩大培养2h；[0082] （11）取1μL菌液进行PCR阳性检测。[0083] 挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，同时扩增产物送测序。扩增和测序引物为插入目的基因两侧的载体序列，分别为：35S‑F：5’‑GACGCACAATCCCACTATCC‑3’；quGUS‑R：5’‑TTCTCTTAGGTTTACCCGCC‑3’。分别验证获得的OsCTP‑EPSPS基因与PFK基因的单表达载体。[0084] 将上一步获得的OsCTP‑EPSPS基因表达载体质粒用KpnI单酶切使其线性化（表4），采用Takara公司相应限制性内切酶产品。[0085] 表4酶切反应体系[0086][0087] 酶切产物纯化后与扩增pUC57‑PFK基因的PCR产物进行与前述相同的重组反应及大肠杆菌转化，PCR检测阳性转化克隆，并测序。扩增和测序引物为插入目的基因两侧的载体序列，引物序列分别为：35S‑F：5’‑GACGCACAATCCCACTATCC‑3’ZT‑CexuR：5’‑GATAATCATCGCAAGACCGG‑3’。[0088] 实施例2单、双价转基因水稻的获得[0089] 本发明分别将含有OsCTP‑EPSPS基因、PFK基因的单价表达载体，以及含有两个基因的双价表达载体通过冻融法分别转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。选择健康（饱满、金黄色）成熟的‘中花11’水稻种子，去壳后经70%乙醇浸润1min后，灭菌水洗涤1次，然后分别用体积比为45%和40%的次氯酸钠溶液消毒两次，各10分钟，共20min，用灭菌去离子水洗涤7‑10次，之后放到无菌滤纸上吸干，最后将种子平放于接种培养基上，一个培养皿摆上10粒左右，28℃黑暗下培养一个月左右。当胚性愈伤组织从种子盾片处生长出来后，选择颜色鲜黄、质地致密的直径1‑2mm的球型愈伤组织，置于愈伤继代培养基上，28℃黑暗下继代培养5‑8d。在进行水稻转化前，将农杆菌涂板于添加了抗生素的YEP（酵母浸粉10.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH7.0±0.2(25℃)）平板上，28℃黑暗下培养2d左右，然后从平板上刮下菌，重新悬浮于含有适量的AAM培养基（酪蛋白氨基酸7.0g，酵母浸粉7.0g，胰蛋白胨5.0g，肉浸粉5.0g，醋酸钠2.5g，吐温801.0ml，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·2H2O0.05g，pH5.4±0.2(25℃)）的三角瓶中，在28℃，200转左右的摇床上摇上2个小时左右，然后用分光光度计测菌液的OD600值，转化适宜的OD600值为0.12‑0.15。同时收集生长旺盛，状态良好的直径2‑3mm的愈伤组织于三角瓶中，将已准备好的农杆菌细胞悬浮液倒入三角瓶，浸泡30min，将愈伤组织转移到共培养培养基上(培养基上铺一层滤纸以抑制农杆菌的过快生长)，19‑22℃黑暗下共培养3 4d。共培养结束后，将愈伤移到三角瓶中，加入无菌水洗涤，~先用无菌水洗涤愈伤组织2 3次，然后用添加了0.5g/L头孢霉素的无菌水洗涤2次，倒掉后~再往内加适量的NBL液体（含0.5g/L头孢霉素），置摇床上摇2个小时，30℃以下，转速50‑200转，之后将愈伤移至无菌滤纸上，吸干多余水分，超净台吹1小时左右，再将愈伤组织转移到选择培养基上（分散在培养基上），28℃黑暗下培养10‑15d。然后挑取从原愈伤组织表面生长出来的新的抗性愈伤组织，转移到预分化培养基上，28℃黑暗下预分化培养7d。选择奶白色、表面光滑、有一定硬度的愈伤组织（可带有部分黄色愈伤）转移到分化培养基上，28℃分化培养：先在黑暗下培养3d，然后在持续冷光照下(5000Lx)，光周期16h昼/8h夜，培养15‑20d。这个过程将看到愈伤组织出现绿点。此后即在同一皿中会有一部分的愈伤直接再生出幼苗，将幼苗转移到壮苗培养基上，持续光照培养15d，光周期16h昼/8h夜，然后转移到温室种植。而将另一部分只有绿点的则再转移到新的分化培养基上继续继代，之后将再生出的苗转移至壮苗培养基上，最后移栽到温室中培养并单株结籽收获T0代种子。使用含有潮霉素的1/2MS培养基筛选阳性转化体植株。培养10d后，观察水稻幼苗的生长情况，发现阳性水稻转化体根和叶正常生长，继续移栽培养单株收获T1代种子（图2），并利用相同的方法收获T2代种子。[0090] 实施例3单、双价转基因水稻对草甘膦抗性水平检测[0091] 采用培养基培养方法，将T2代三种水稻转化体及野生型的种子手动脱壳，70%酒精浸泡5min，40%次氯酸钠溶液浸泡20min，中间震荡5min，去次氯酸钠，去离子水洗脱6次，使用滤纸吸干水分。将种子均匀铺在含有潮霉素（40mg/L）的1/2MS培养基（pH5.9）上，放入智能光照培养箱（光周期14h/10h，28°C/25°C，湿度60%）培养12d。阳性苗与阴性苗的鉴定标准为：阳性植株的生长状态良好，阴性植株生长受到抑制，下胚轴生长缓慢，营养土和蛭石按照体积比3:1混匀装土填入小花盆中，将阳性水稻幼苗移栽到土中，使用保鲜膜保湿一天，置于培养温室（光周期14h/10h，30°C/28°C），继续培养。待水稻生长至5叶期。为检测水稻转化体对草甘膦的敏感性，对水稻株系喷施不同浓度的草甘膦药剂，针对‘中花‑111’和PFK水稻转化体喷施0，112.5，225，450，900，1800ga.i.ha ，转基因OsCTP‑EPSPS水‑1稻及双价转基因水稻喷施0，900，1800，3600，7200，14400ga.i.ha ，每个剂量设置4个重复。继续培养21d后，称量鲜重计算鲜重抑制率，并通过统计软件SigmaPlot12.0（SystatbSoftware,SanJose,CA.）中的Y=y0+a/(1+(X/X0))模型计算GR50值，式中Y代表鲜重抑制率，X代表处理剂量，X0代表GR50，b代表曲线在X0处的斜率，a代表待测指标上限与下限的差值，y0代表待测指标下限。抗性倍数（RI）计算方法转基因植物的GR50值与野生型植物的GR50‑1的比值。结果发现草甘膦对双价转基因水稻的抑制中浓度为4125.5gaiha ，是野生型种群的15.0倍（表5），转OsCTP‑EPSPS基因的水稻抗性倍数是野生型水稻的13.6倍，而转PFK基因的水稻敏感性水平与野生型相当。[0092] 表5双价转基因水稻对草甘膦抗性水平的整株植物测定[0093][0094] 注：X0代表GR50，b代表曲线在X0处的斜率，a代表待测指标上限与下限的差值，y0代2表待测指标下限，RI代表抗性倍数，R为模型拟合度，P值（显著性水平），用于评估拟合曲线的统计显著性。[0095] 实施例4单、双价转基因水稻EPSPS与PFK表达量检测[0096] 用实施例3相同的方法培养单、双价转基因水稻T2代幼苗至5叶期，取新鲜的水稻叶片提取RNA，获得cDNA文库，使用荧光定量技术检测EPSPS及PFK基因的表达，检测EPSPS基因表达引物为（F5’‑GGTGGCAAGGTTAAGTTATCTGG‑3’,R5’‑TCAACATAAGGGATGGAGATCAG‑3’）；检测PFK基因表达的引物为（F：5’‑GCCAAAGGGTCTATTTTGAGTC‑3’R：5’‑GAAGCCTCTATACCCACCCTGA‑3’）筛选合适表达量的转化体株系用以功能验证实验。用以检测EPSPS、PFK表达量的引物同牛筋草的引物一致，水稻内参引物为（Ub‑F：5’‑GGGTTCACAAGTCTGCCTATTTG‑3’；Ub‑R：5’‑ACGGGACACGACCAAGGA‑3’）。结果发现，与内参基因表达量比较，转EPSPS基因水稻植株的EPSPS表达量均值为149.2；转PFK基因水稻植株的PFK表达量均值为67.0；双价表达载体的水稻EPSPS基因的表达均值为153.1倍，PFK表达量均值为214.1（图3）。[0097] 实施例5单、双价转基因水稻生物量及产量检测[0098] 采用与以上实施例相同的方法温室培养单、双价转基因水稻T2代幼苗经荧光定量表达检测后继续培养，移栽60d后，测量分蘖数：转基因及野生型水稻各选取24株，统计每株植株所有的分蘖数并记录。株高：转基因及野生型水稻各选取24株水稻，用卷尺测量从土壤表面到主茎的最高处的高度。生物量：转基因及野生型水稻各选取24株水稻，称量植株地上部分整体的重量（鲜重），收集至信封中，放入75℃烘箱中烘干48h后，称重干重并记录。叶面积：转基因及野生型水稻各选取24株水稻，完整剪取所有叶片，使用叶面积仪测量所有叶子的面积并使用Excel整理求和，计算每株的叶面积。成熟后测量单株所有种子数量级重量。统计水稻的分蘖数、株高、鲜重、干重、所有叶片的叶面积及单株结籽数量及重量。使用SPSS25.0中选择单因素ANOVA检验，事后多重比较沃勒‑邓肯（W），若不满足方差齐性检验使用非参数检验（Kruskal‑Wallis），再次分析，P<0.05表现存在显著性。检测结果发现双价转基因水稻在植株鲜重、干重、叶面积、单株结籽重量和数量都显著高于单价转基因及野生型植株（表6和图4）。[0099] 表6单、双价转基因水稻生物量产量等指标检测[0100][0101] 注：同一列不同字母表示该指标转基因与野生型水稻之间存在显著差异。[0102] 实施例6单、双价转基因拟南芥的制备[0103] 将拟南芥叶绿体信号肽序编码序列（AtCTP）与抗草甘膦基因EPSPS功能性的拼接在一起，标记为AtCTP‑EPSPS，人工合成AtCTP‑EPSPS并将合成的基因克隆于pUC57载体，所得到载体标记为pUC57‑AtCTP‑EPSPS。人工合成提高植物生物量和产量的基因PFK于pUC57载体，所得到载体标记为pUC57‑PFK。采用与实施例1相同的方法（pUC57‑AtCTP‑EPSPS‑F为：5’‑ATGGCGCAAGTTAGCAGAAT‑3’）构建单价及双价表达载体。草炭：蛭石：珍珠岩按照体积比1:3:0.5加水混匀，高压灭菌后装盆，取适量拟南芥野生型种子播撒入育苗钵的土中，盖上保鲜膜，放入人工气候箱，光暗交替培养（16h/8h），温度22‑24℃培养至拟南芥展开2片真叶时移栽至9cm×9cm的育苗钵，并继续在人工气候箱培养。拟南芥主花序开花后，将花序浸入不同表达载体的农杆菌菌液(OD600为0.8‑1.0)中，1分钟后拿出，将花序上包裹保鲜膜。24h后将包裹的保鲜膜揭开，放置灯光下，正常管理至收种。收种后的转基因T0代种子在4℃冰箱保存1周左右（春化）。制作添加潮霉素（20mg/L）MS培养基。取适量T0代种子，放入1.5ml离心管中，75%酒精消毒5min，无菌水洗5遍，备用。超净工作台中，将消毒后的种子，铺在上述制作的添加筛选压的MS培养基上，分散均匀。晾干，用石蜡膜封口。将铺满种子的平板，放在光暗交替培养（16h/8h），22‑24℃条件下，使种子萌发。待幼苗第一对真叶展开，且生根，即可移栽。将有真叶并生根的幼苗移栽到混合草炭、蛭石和珍珠岩的育苗土中。利用上述相同的方法继续获得单、双价T2代拟南芥种子。[0104] 实施例7单、双价转基因拟南芥对草甘膦抗性水平检测[0105] 采用实施例6相同的方法将收种后的转基因T2代单、双价种子在4℃冰箱保存1周左右（春化）。制作添加草甘膦铵盐原药（采购自浙江新安化工集团股份有限公司）的MS培养基。取适量T2代种子，放入1.5ml离心管中，75%酒精消毒5min，无菌水洗5遍，备用。超净工作台中，将消毒后的种子，按行平铺在上述MS培养基（草甘膦的浓度分别为0、10μM）上，晾干，用石蜡膜封口，放在光暗交替培养（16h/8h），22‑24℃的条件下培养1周，调查种子萌发及根长情况判断单、双价转基因拟南芥对草甘膦的耐受性。结果发现，各种转化体和野生型拟南芥在不含草甘膦的培养基种生长正常，双价和转AtCTP‑EPSPS的转基因拟南芥对10μM草甘膦具有耐受性，而转PFK的拟南芥及野生型拟南芥已经死亡（图5）。[0106] 实施例8单、双价转基因拟南芥生物量及结籽量检测[0107] 采用实施例6相同的方法，将不同单、双价转基因及野生型拟南芥的种子消毒后在MS培养基培养至展开2片时期，移栽至花盆中。移栽后的拟南芥分为两批，一批在营养生长期（培养30天左右），检测生物量及叶面积。另外一批则继续培养至成熟并收种子。检测结果发现双价转基因拟南芥的植株干重、叶面积、单株结籽数量和单株结籽重量四个指标都显著高于其他三种转基因类型（表7）。[0108] 表7单、双价转基因拟南芥生物量产量等指标检测[0109][0110] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。