【干货分享】CRISPR/Cas系统原理及Cas9与Cas12a区别

• 花匠小妙招
• 2024-12-30 07:44

2023-10-20 03:53点击次数：2664

关键词：Cas12a

一、CRISPR/Cas系统简介
CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌保护自身免受外来遗传物质影响的适应性免疫系统，该系统发挥功能包括三个阶段：第一阶段是适应，细菌通过特定Cas蛋白从入侵的核酸中识别PAM位点（原间隔序列相邻序列）并将原间隔序列整合到细菌自身的CRISPR序列中；第二阶段是表达和成熟，CRISPR转录为pre-crRNA（RNA前体物），通过酶加工为成熟的crRNA，与Cas蛋白结合形成复合物；第三阶段是干扰，crRNA引导复合物识别入侵核酸PAM靶点，并激活Cas蛋白内切酶活性，切割目标DNA序列。

 
二、CRISPR/Cas系统分类
CRISPR/Cas系统分为两类六型，1类包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型，通过多个Cas蛋白发挥功能，占已鉴定CRISPR/Cas位点的90%；2类包括Ⅱ型（Cas9）、Ⅴ型（Cas12）和Ⅵ型（Cas13），通过单一的Cas蛋白发挥功能，占已鉴定CRISPR/Cas位点的10%，是理想的基因编辑和体外检测工具。

三、Cas12a与Cas9的区别
1.crRNA
对于Cas9，当外源核酸入侵后，细菌会转录出tracrRNA，同时Cas9蛋白被转录翻译，而Cas1、Cas2和Csn2会附着在Cas9蛋白上；然后CRISPR序列在前导区的调控下转录生成Pre-crRNA，Pre-crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对形成双链RNA，同时与Cas9蛋白组装形成复合体，最终根据入侵核酸的类型选取对应的间隔序列，利用RNaseⅢ去掉其他无关序列，形成成熟的sgRNA（single guild RNA）。

而Cas12a由于具有核糖核酸内切酶活性，当pre-crRNA转录后，Cas12a可直接将pre-crRNA直接加工成熟，无需tracrRNA和RNaseⅢ的参与，同时Cas12a还具有RNA引导的DNase活性，能对靶DNA进行裂解。                                                                                                                                             

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2.PAM位点和结构域
Cas9靶向DNA序列的PAM为5’-NGG-3’，位于非目标链间隔序列下游。Cas9核酸内切酶包括一个HNH核酸酶结构域和一个RuvC-like核酸酶结构域，两个结构域都用于切割DNA，其中HNH核酸酶结构域切割与crRNA互补的DNA链，而RuvC-like结构域切割另一条非互补链，切割位点为PAM上游原始间隔序列第3和第4个核苷酸之间，产生平末端的DSB。

Cas12a识别富含T的PAM序列，如LbCas12a的PAM序列为5’-TTTN-3’，FnCas12a的PAM序列为5’-TTN-3’，位于非目标链间隔序列上游。Cas12a由REC叶和Nuc叶组成双叶结构，Cas12a具有切割能力的结构域位于Nuc叶上。Nuc叶由RuvC结构域、PI结构域和WED结构域组成，其中用于处理自身crRNA的RNase位点位于WED结构域；用于切割DNA的DNase位点位于Nuc和RuvC结构域之间的界面上，并且Ruvc结构域含有催化中心，能够准确识别目标序列，并在Mg2+的催化下进行精确的DNA切割，产生粘性末端的DSB。

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3.作用机制
Cas9切割DNA使双链断裂后，细胞启动DNA损伤修复机制修复DSB。细胞中存在两种不同的修复机制，一种为非同源末端连接（NHEJ），这种修复方式可能会产生小片段的插入、缺失和替换，且当插入或缺失的碱基长度非3的倍数，就会导致该基因在后续翻译时产生的氨基酸与原基因翻译的氨基酸完全不同，达到基因KO的目的；另一种修复机制为同源重组介导的修复（HDR），这种修复方式修复后DNA双链与断裂前一致，但细胞内主要的修复方式往往是NHEJ，且即使DNA通过HDR修复后也还是会继续被sgRNA识别并再一次进行切割。

Cas12a的RuvC结构域中存在几个特殊部位：REC Linker（简称Linker），又称为Rec连接子，是连接REC1和REC2结构域的环状连接肽；Lid，在关闭载脂蛋白的催化位点方面发挥作用；Finger：REC1中的指状螺旋结构。在crRNA和靶DNA杂交之前，Lid关闭，Linker和Finger静默；crRNA和靶DNA杂交后，Lid打开，使Cas12a催化口袋可用；当Cas12a切割双链DNA后，Lid改变构象形成α螺旋，从而与杂化组装的crRNA相互作用，Linker和Finger使REC结构域远离RuvC结构域，此时dsDNA底物远端部分与复合物分离后，该部位催化位点暴露，可以无差别切割周围的ssDNA，称为反式切割。这种无差别切割可以将信号方法，结合探针，可以开发出更简便、更快速、更精准的体外检测方法——CRISPR检测！www.edgene.cn

 
四、总结

  Cas9 Cas12a 发现日期 2012年 2015年 Cas家族类型 Ⅱ型 Ⅴ型 蛋白大小 1000-1600个氨基酸 1300个氨基酸 gRNA crRNA和tracrRNA crRNA Pre-crRNA加工 需要宿主RNaseⅢ和tracrRNA参与 依靠内在RNase活性加工 PAM序列 富含G的PAM序列 富含T的PAM序列 核酸酶位点 HNH和RuvC RuvC-Nuc 切割方式 平末端（PAM序列上游） 黏性末端（PAM序列下游） 作用机制 依靠切割后的细胞修复机制 依靠Cas12a的反式切割活性 艾迪基因专注于发展和优化基于CRISPR/Cas的基因组编辑技术，技术团队通过自主开发的Fish-bait纯化工艺，获得了性能更好的Cas12和Cas13基因编辑蛋白，并开发了特有的crRNA设计逻辑。由此建立了FASST检测技术，大大提高了Cas酶切割活性和CRISPR检测的灵敏度。

 
酶活性对比图

LbCas12a活性对比测试
 

LwaCas13a活性对比测试
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