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【Nature子刊】缺氧促进肿瘤侵袭迁移再添实锤，缺氧研究竟可以这样玩转！

花匠小妙招
2024-12-31 14:50

众所周知，氧气对于人体细胞的生存和运作都是必需的，缺乏氧气时，健康细胞成长受到限制。但令人惊奇的是，缺氧却是90%的实体瘤中广泛存在的一种特质，缺氧在细胞发育和疾病过程中对细胞增殖、代谢、迁移和血管生成有深远的影响[1-2]。
当氧气含量在生长中的肿瘤中下降时，缺氧就会激活一种名为HIF1（缺氧诱导因子）的基因，并通过发挥其转录调节因子的作用，调控细胞对缺氧的响应[3]，会降低乃至关闭线粒体中的耗氧过程，尤其是氧化磷酸化，从而使得糖酵解成为癌细胞主要的能量产生方式。2019年的诺贝尔生理学或医学奖，正是颁发给了HIF1通路的三位奠基人。

大量研究证实肿瘤缺氧（即肿瘤部分区域含有极低浓度的氧气），与增强的侵袭性行为和更差的预后相关，如缺氧性膀胱癌会发生肺部转移[4]，缺氧促进黑色素通过淋巴系统从皮肤转移到体内其他部位[5]，缺氧已被确定为患者预后的不良指标[6]。绝大多数关于缺氧调节基因表达的研究都是在体外环境下进行的，即使用与正常空气相同的氧气浓度来培养肿瘤细胞，然后再将细胞短时间暴露于1%的氧气中。实际上，这比体内的氧气含量高的多，可能并不能模拟肿瘤细胞缺氧的真实情况。近日，约翰·霍普金斯大学医学院的研究人员在《Nature Communications》杂志发表了题为Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis的最新成果，建立一种新的缺氧命运映射系统，揭示在体内经历肿瘤内缺氧的细胞与体外暴露于缺氧环境的细胞具有不同的基因表达模式。体内缺氧后肿瘤细胞具有抗ROS表型，在血流中提供生存优势，表现出增强的侵袭、转移表型，显示更强的转移能力[7]。

结果

1 建立缺氧命运映射系统为了研究和跟踪缺氧细胞在肿瘤发生过程中的命运，研究人员通过慢病毒载体，建立了一种双载体缺氧命运映射系统来永久标记缺氧细胞。载体1包含一个改造的Cre基因（添加一个HIF调控的氧依赖的降解域（ODD）），载体2表达一个红色荧光报告蛋白（DsRed），其终止密码子位于一个绿色荧光蛋白(GFP)基因编码前的串联loxP位点（图1b）。在缺氧条件下，HIF诱导Cre的转录激活，Cre切掉DsRed基因，从而引起GFP的持续表达。分别对MDA-MB-231、MCF7和4T1乳腺癌细胞稳定转导此载体系统后，通过活细胞不同时间间隔成像、流式细胞术和免疫印迹分析来表征不同O2浓度的时间和敏感性，各种细胞系显示相似的结果（图1c-f）。

图1 建立缺氧细胞命运映射系统

同时，研究人员构建了一种转基因小鼠模型，它同样以缺氧依赖的方式表达CRE基因（载体1）（图1b，图2a,b）。通过靶向位点扩增(TLA)和下一代测序，研究人员确定了转基因的确切整合位点、拷贝数、序列和定位（图2b）。通过分别与表达tdTomato（串联floxed和GFP）的小鼠及MMTV-PyMT小鼠交配获得三转基因小鼠（图2a,b）。研究人员系统地研究了缺氧过程中每个阶段的乳腺癌进展（导管增生，导管原位癌（DCIS），早期癌，晚期浸润性癌），并定位了缺氧部位。研究发现，瘤内缺氧首先出现在导管原位癌病变中（图2c）。

图2 建立缺氧命运系统的三转基因小鼠模型

2 三维培养中缺氧细胞的分布为了探索这个系统在体外3D培养时，对低O2浓度细胞的效用，研究人员三维培养携带命运映射系统的MDA-MB-231或MCF7细胞（图3a），结果表明，在三维球体中培养的细胞可以根据其在球体中的位置和培养时间暴露在不同水平的O2下，随着时间的推移，表达GFP核的大小增加了一半以上（图3c），同时GFP+细胞可以从球体的中心迁移到更富氧的球体边缘（图3b）。进一步验证三转基因小鼠缺氧效应，来源乳腺导管原位癌表达tdTom的病变组织的类器官，培养在20%或0.5% O2下（图3e），缺氧探针结合荧光流式检测等实验表明，3D培养的类器官产生严重的O2梯度（14%到1.7%）；随着时间的推移，O2水平的变化可能是一个重要的环境线索，它决定了3D培养中所培养的类器官细胞中单个细胞或细胞簇的命运。

图3 缺氧细胞在三维模型中的命运图

3 瘤内缺氧细胞的命运映射进一步接种携带命运映射系统的乳腺癌细胞MDA-MB-231或4T1到小鼠乳腺脂肪垫，构建原位肿瘤模型，在不同的时间点切除肿瘤（图4a）。研究人员使用固定微探针直接测量瘤内O2浓度，将荧光表达与瘤内O2浓度联系起来，结果表明细胞在体内经历<0.5% O2时表达GFP（图4b）。缺氧标记的细胞定位于肿瘤的坏死区，与GFP+和HIF-1α染色共定位（图4 c）。GFP+细胞与血管共标，到达肿瘤的侵袭性前缘（图4d），结果显示部分缺氧细胞有能力从肿瘤的坏死区域迁移到含氧较多的组织区域。注射MCF7细胞60天后，显示出缺氧区域（GFP+），并破坏了导管壁的基膜（图4f），表明MCF7模型导管内中形成侵袭性结构。

图4 瘤内缺氧细胞的命运映射

4 瘤内缺氧可作为一种预后工具研究人员进一步对瘤内缺氧引起的基因表达变化与在体外缺氧条件下的变化进行了比较，体外研究中，将细胞暴露于20%或1%的O2培养 24小时，然后进行RNA测序。体内则是从3mm的肿瘤中分选了GFP+和DsRed+癌细胞，进行RNA测序。数据表明：体外缺氧培养不能反应肿瘤内缺氧的情况，体外培养缺氧后再恢复氧气水平（20%O2下培养2天）会逆转改变的基因；瘤内缺氧诱导的基因表达，即使在标准组织培养后，也不完全可逆（图5）。进一步比较肿瘤内和体外缺氧暴露重叠产生的41个基因，以及肿瘤内和体外缺氧亚群中差异表达最大基因的生存相关性。瘤内差异基因和重叠的41个基因具有最显著的预后潜力（图5f-h）。

图5 瘤内缺氧是一种预后工具

5 缺氧后细胞具有增强的转移潜能为研究原发肿瘤细胞坏死周围缺氧的细胞是否具有向远处器官转移的能力，研究人员从携带低氧标记MDA-MB-231肿瘤的小鼠体内取出3mm大小的肿瘤，并收集匹配的血液和肺组织，评估其在切除肿瘤时或两周后DsRed+和GFP+细胞的比例（图6a）。在切除肿瘤时，原发肿瘤中有不到25%的细胞为GFP+，而在血流中发现的DsRed+和GFP+细胞数量相似。结果表明，缺氧的细胞进入血流的可能是正常DsRed+细胞的四倍（图6b）。GFP+细胞将肺作为单个或聚集细胞播散的可能性增加了4至5倍（图6c-e）。肿瘤切除三周后，我们评估了GFP+细胞形成明显大转移的能力。GFP+细胞比DsRed+细胞形成肺转移的可能性高6-7倍（6 f-h）。评估了8只三转基因FVB小鼠和同基因4T1模型的肺转移，并观察了在免疫环境下相似的转移能力（图6i, j）。为了确定DsRed到GFP的转换不会在循环中发生，也不会在到达远处器官后发生，作者将流式细胞分选的DsRed+细胞直接尾静脉注射到小鼠体内。细胞在肺定植后仍保持DsRed+（图6k），反映了该器官与瘤内区域相比处于较高的O2水平。同时证实了绿色荧光蛋白开关发生在原发肿瘤，而不是在循环系统或肺内。研究结果表明(1)肿瘤坏死区周围的部分低氧细胞可以克服缺氧并转移；(2)离开原发肿瘤缺氧区进入血流的细胞暴露于较高的O2水平(复氧)；(3) 在原发肿瘤中，血液和肺中检测到的GFP+细胞缺氧；(4)缺氧后细胞在血液和肺中被发现的机会增加4-5倍。

图6 缺氧后细胞具有增强的转移潜能

6 瘤内缺氧促进侵袭GFP+细胞在血液中被发现的概率比DsRed+细胞高4倍，表明它们能够更好地完成转移级联的早期步骤，包括局部侵袭、內渗进入和血管和在血流中的存活（图7a）。为了比较GFP+和DsRed+细胞的侵袭性，研究人员从原发肿瘤中分离出癌细胞，并将其与90%未标记的MDA-MB-231细胞合并，生成球状体以跟踪细胞迁移（图7b）。GFP+细胞多定位于侵袭性的椭球前缘（图7c-f）。

图7 瘤内缺氧促进侵袭

7 缺氧后CTC具有抗ROS表型侵袭并不是转移的限速步骤，因为在侵袭性肿瘤患者中，每天有成千上万的CTC脱落，其中只有一小部分发生转移。推断除了增强的侵袭外，GFP+细胞可能在血流中具有生存优势。研究表明，氧化应激是转移过程中的一个限制性步骤，因其阻止了CTCs在血流中的存活，进一步验证GFP+细胞是否更能抵抗氧化应激（图8a）。为了直接评估线粒体ROS水平，作者分离了小鼠原发肿瘤和血液中的GFP+和DsRed+癌细胞，并对其进行了MitoROS染色。与原发肿瘤相比，DsRed+细胞在血液中的ROS水平增加了2倍，而GFP+细胞在肿瘤和血液中的ROS水平保持不变（图8b）缺氧后细胞在原发肿瘤中获得了抗ROS表型，增加迁移、內渗及血管中存活的能力，从而促进它们在肺部的转移定殖。

图8 缺氧后CTC具有抗ROS表型

8 转移部位存在缺氧 “记忆”为了确定抗ROS表型是否会在成功定殖肺的细胞中持续存在，研究人员进行了RNA测序分析。与DsRed+转移细胞相比，GFP+中有121个基因上调，47个基因下调。为了确定哪些基因在瘤内缺氧和随后的GFP+和DsRed+肺转移中上调，研究人员比较了基因的表达谱。在原发肿瘤和肺转移性的GFP+和DsRed+细胞中，共有19个RNA转录被调节（图9a），RNA样本证实了CA9、CP、DNAH11和EGLN3的表达（图9b）。已知19个基因中有9个以缺氧调节和HIF依赖的方式调节（图9c）。通过比较肿瘤与肺组织中GFP+和DsRed+细胞的表达，作者发现原发肿瘤与肺转移之间的变化是一致的。表明原发肿瘤缺氧诱导的基因在转移部位仍然过表达，显示出“低氧记忆”。这些基因可以作为生物标志物来识别肿瘤内缺氧转移部位的细胞。

图9 转移部位存在缺氧 “记忆”

结论：

文章通过慢病毒载体，建立了一种双载体缺氧命运映射系统来永久标记缺氧细胞，以确定它们对不同生理环境O2梯度的反应，并研究它们对转移扩散的作用。

通过构建二维和三维的培养系统，小鼠原位成瘤模型以及尾静脉注射小鼠实验，充分表征了缺氧细胞在癌症发展至转移过程中的命运。研究表明，在体内经历肿瘤内缺氧的细胞与体外暴露于缺氧环境的细胞具有不同的基因表达模式。体内暴露于慢性低氧环境赋予癌细胞以增强的侵袭、转移和抗ROS的表型，从而在血液中再充氧时促进其存活，并更有可能扩散到远处的组织。

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参考文献

[1] Kim, J. W., Gao, P. & Dang, C. V. Effects of hypoxia on tumor metabolism.Cancer Metastasis Rev. 26, 291–298 (2007).

[2] Chen, J., Imanaka, N. & Griffin, J. D. Hypoxia potentiates Notch signaling in breast cancer leading to decreased E-cadherin expression and increased cell migration and invasion. Br. J. Cancer 102, 351–360 (2009).

[3] Dengler, V. L., Galbraith, M. D. & Espinosa, J. M. Transcriptional regulation by hypoxia inducible factors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 49, 1–15 (2014).

[4] Thomas S et al. CD24 is an effector of HIF-1-driven primary tumor growth and metastasis. Cancer Res. 2012 Nov 1;72(21):5600-12.

[5] Hanna SC et al.HIF1α and HIF2α independently activate SRC to promote melanoma metastases. J Clin Invest. 2013 May;123(5):2078-93.

[6] Cosse, J.-P. & Michiels, C. Tumour hypoxia affects the responsiveness of cancer cells to chemotherapy and promotes cancer progression. Anti-Cancer Agents Med. Chem. 8, 790–7 (2008).

[7] Inês Godet et al. Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis. Nat Commun. 2019 Oct 24;10(1):4862. doi: 10.1038/s41467-019-12412-1.

转自微信公众号和元上海

原文链接：

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