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野生毛花猕猴桃asa含量的关联分析

花匠小妙招
2025-01-02 11:09

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野生毛花猕猴桃AsA含量的关联分析
毛花猕猴桃(ActinidiaerianthaBenth.)果肉翠绿色,风味较浓,具有较强的抗病性。目前商业栽培的猕猴桃种类主要是中华猕猴桃、美味猕猴桃(牛歆雨等,2007),生产中应用的毛花猕猴桃品种极少。毛花猕猴桃绝大部分处于野生状态,主要分布于长江以南的宽阔丘陵地区,其中以江西、湖南、福建、广西等地的野生种质资源最为丰富。毛花猕猴桃是猕猴桃属植物中抗坏血酸(ascorbicacid,AsA)含量较高的种类之一,~-1FW,是中华猕猴桃的3~4倍(钟彩虹等,2011)。由于具有这些特性,毛花猕猴桃具有宽敞的开发利用前景。
近年来,国内外有关植物体内AsA的争论主要集中在抗氧化作用、光合爱惜、增加酶活性、促进细胞分裂、植物信号传导等方面的功能分析、AsA合成途径与降解、转运与运输等生理代谢过程等方面。同时,在对植物抗坏血酸相关酶基因的争论上已在刺梨(安华明等,2005)、柑橘(杨晓燕,2011)和猕猴桃(Laingetal.,2007;Bulleyetal.,2009)等果树中广泛开展。而对于毛花猕猴桃的争论只侧重于AsA合成途径及相关基因的克隆等相关争论(Crowhurstetal.,2008;侯长明等,2009)。有关野生毛花猕猴桃叶片和果实AsA含量与SSR标记的关联分析尚未见报道。
关联分析(associationanalysis,AA)作为在植物数量性状争论和植物育种中的最新开头应用的一种分析方法,它通过鉴定种质群体内性状与分子遗传标记或候选基因的关系,可以使QTL分析得到补充和提高,使目标性状精确定位并可广泛应用而不受杂交群体的限制(杨小红等,2007)。依据扫描范围,关联分析可分为全基因组和候选基因两种途径(Flintetal.,2003)。全基因组关联分析基于遗传标记,可以对目标性状进行染色体定位;而候选基因关联分析则是对候选目的基因序列在种质间的差异进行争论,可以更加精确地鉴定优异等位基因。Hansen等(2001)最早通过全基因组关联分析查找出与野生甜菜抽薹基因紧密连锁的标记,加快了候选基因的定位进程。曹珂等(2012)在对桃的单果质量与6个物候期性状的遗传进行关联分析争论时得到了27个与桃单果质量及6个物候期性状关联的数量性状位点。文自翔等(2008)在对中的关联分析中检测出栽培群体的大豆和野生大豆种质中分别有27个和34个位点与农艺形状性状相关。Breseghello和Sorrells(2006)利用18个SSR标记对95份小麦品种的籽粒性状进行了关联分析,结果发觉Xwmc111、Xgwm30和Xgwm261与籽粒宽度存在显著相关。此外,全基因组关联分析还在其他一些作物上得到了广泛的应用,但在猕猴桃中尚未见报道。随着关联分析在分子遗传育种和基因组学争论中的不断深化,通过分子标记的开发、查找候选基因及功能基因验证的争论,为进一步揭示数量性状的遗传机制及作物的遗传改良供应了新的途径。
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在对江西省武功山境内野生毛花猕猴桃资源调查收集的70份野生种质叶片和果实的AsA含量变异分析的基础上(汤佳乐等,2013),利用掩盖全基因组的SSR引物分析其遗传多态性,旨在为野生毛花猕猴桃资源的合理开发与利用奠定基础。同时运用一般线性模型(generallinearmodel,GLM)和混合线性模型(mixedlinearmodel,MLM)进行野生毛花猕猴桃AsA含量的关联分析,查找与AsA含量相关的标记位点,为揭示野生毛花猕猴桃AsA生成的分子特征供应理论依据,以促进有效改良猕猴桃的果实性状与种质创新。
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1、材料与方法

2012年7月中旬在江西省武功山境内随机采集70份野生状态下毛花猕猴桃种质的健康无损伤的成熟叶片,用冰盒保存并运回试验室。用CTAB法提取野生毛花猕猴桃幼嫩叶片的基因组DNA,用紫外分光光度计检测DNA质量和浓度,20℃保存备用。

参照Testolin等(2001)用SSR构建了猕猴桃遗传连锁图,选用广泛分布在猕猴桃基因组中70对SSR引物(PalombiDamiano,2002;Zhenetal.,2004;Korkovelosetal.,2008),首先对8个AsA含量差异较大的野生毛花猕猴桃种质材料进行扩增,筛选出多态性较好的21对SSR引物,再对70份野生毛花猕猴桃种质资源进行扩增。PCR扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性45s,50~60℃退火45s,72℃延长45s,30个循环;72℃延长10min。扩增产物用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,快速银染法染色。
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利用MicrosoftOfficeExcel对野生毛花猕猴桃成叶和幼果的AsA含量进行统计,依据丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测的结果,将每条SSR引物扩增的每一条带视为1个位点,统计位点总数和多态性位点数多态性信息含量(PIC)等参数值,相同迁移率的记为1,无条带的记为0,不具多态性的条带不予统计。,并计算材料相应的群体结构Q值以确定70份野生毛花猕猴桃种质群体的遗传结构。先假定各个位点均是独立的,并估算最佳群体数(K),K的取值范围为2~10,将MCMC(markovchainmontecarlo)开头时的不作数迭代(lengthofburn-inperiod)设为10000次,再将不作数迭代后的MCMC设为10000次,然后选取一个合适的亲缘关系K值。
。GLM分析中以Q值作为协变量进行回归分析;MLM接受群体结构Q值和亲缘关系K值相结合的方法进行分析,选择计算每个标记的遗传力(calculateheritabilityforeachmarker)的计算方式,分析方法选择EM。利用AsA含量表型变异数据对标记逐一进行回归分析和关联作图,并计算标记对表型变异的解释率。
2、结果与分析

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利用70条广泛分布于猕猴桃基因组的SSR引物对野生毛花猕猴桃材料进行扩增,52条引物能够扩增出条带,且每条引物能够扩增出2~12条带。再对52条SSR引物进行筛选,得到稳定性好、扩增性强和多态性好的SSR引物21条,一共扩增出127个多态性等位位点。通过对野生毛花猕猴桃基因组PCR扩增,多数SSR引物能够在野生毛花猕猴桃材料中表现出多态性,不同的SSR引物的扩增结果在总等位位点数、多态性位点数、等位位点亮度等方面都表现出了差异。在70份毛花猕猴桃材料中,21条SSR引物扩增得到的基因片度长度或许在75~400bp的变化范围,等位位点数目在2~12之间,,其中引物722检测到了5个等位位点变异(图1)。利用SSR标记对野生毛花猕猴桃扩增得到的图谱,将扩增得到的多态性位点进行赋值进行关联分析。

为了估测野生毛花猕猴桃种质群体的遗传结构,基于SSR标记的数据,。对70份野生毛花猕猴桃种质进行组群划分结果测试,重复10次,2~10组群(K=2,3,4,,10),将测试过程中不同的等位变异频率特征类型数K给出的不同的lnP(D)平均值(似然值),绘制成散点图(图2)。基于数学模型的群体结构分析发觉样本中的lnP(D)随着K值得增加呈持续增大。因此,最佳的群体结构数必需通过K来确定。由图3可以看出,K在K=4消逝拐点。依据Evanno等(2005)的描述,可以推断70份野生毛花猕猴桃群体可被分为4个亚群(图4)。这4个亚群分别包含14、17、21和18份材料。
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从前期争论结果(汤佳乐等,2013)中发觉,70份野生状态下的毛花猕猴桃桃种质资源不同植株的成熟叶片和幼嫩果实AsA含量存在丰富的变异,%%,反映了野生毛花猕猴桃种质中存在较大的的遗传差异。本争论中则是基于对野生毛花猕猴桃精确测定成熟叶片和幼嫩果实的基础上,经过SSR多态性分析和群体遗传结构分析,将野生毛花猕猴桃群体分为4个亚群,。
在GLM模型中,以4个亚群中的各个材料所对应的群体结构Q值作为协变量,将SSR标记与AsA含量的变异进行回归分析,查找与AsA含量相关联的标记并确定其解释率;在MLM模型中,接受群体结构Q值和亲缘关系K值相结合的方法进行回归分析,并确定其相关联标记的解释率。
GLM模型分析结果(表1)显示,,所检测的21对SSR引物的127个多态性标记位点中,有7个SSR标记位点与叶片和果实的AsA含量相关。有4个标记位点与叶片的AsA含量相关,4个与果实的AsA含量相关,其中标记位点UDK97-414同时与叶片的AsA含量、果实的AsA含量相关。~,解释率最大的标记位点是UDK96-040,,与果实的AsA含量相关,其次是标记位点UDK96-053,;而解释率最小的标记位点是761,,与叶片的AsA含量相关。
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MLM模型分析的结果(表1)显示,,共有6个SSR标记位点分别与叶片和果实AsA含量相关,比GLM模型分析结果中的少1个,其中有5个SSR标记位点与GLM模型分析所得到的相同,标记位点751只有在MLM模型分析中检测到,。标记位点UDK97-414同时与叶片和果实的AsA含量相关。~,低于GLM模型分析得到的解释率。
3、争辩

AsA含量作为衡量果实品质中一个重要的指标,选育出高果实AsA含量的品种始终是育种工作者的目标之一。因此分析毛花猕猴桃AsA含量的多样性以及基于SSR分子标记的多态性分析,对于猕猴桃育种工作具有重要的指导意义。本争论中以AsA含量变异丰富的野生毛花猕猴桃种质为材料,在前期进行叶片和果实AsA含量变异分析的基础上(汤佳乐等,2013),利用SSR分子标记进行多态性分析,21条多态性高的SSR引物一共检测出127个等位变异位点,扩增得到的基因片度长度或许在75~400bp的变化范围,变异范围在2~12之间,。可见,野生毛花猕猴桃不仅在叶片和果实AsA含量上具有丰富的多样性,而且基于SSR分子标记在对野生毛花猕猴桃种质材料的识别和区分上也具有多态性高的特点。野生毛花猕猴桃叶片和果实AsA含量变异的多样性及基于SSR的多态性分析结果表明,本争论所选择的资源群体适合于开展野生毛花猕猴桃AsA含量的关联分析。通过对野生毛花猕猴桃种质材料的叶片和果实AsA含量与SSR标记的关联分析,将有助于深化发掘并充分利用高AsA含量的基因资源,加速高AsA含量基因的争论和育种改良。
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对供试种质资源进行遗传多样性和群体遗传结构评价,是进行关联分析的前提和基础(HarrisStokesbury,2010)。本争论中使用STRUCTURE软件对供试野生毛花猕猴桃种质进行的基于SSR标记的群体结构分析,70份供试种质可以分为4个亚群,分别包含14、17、21和18份材料。群体分析的结果分析是通过计算各个供试种质相应的Q值,进行基于数学模型的聚类划分,通过将野生毛花猕猴桃群体中各个种质的所得到相应的Q值作为协变量纳入回归分析中,校正了70份种质材料的群体结构,较大程度上削减群体结构对关联分析的影响,降低供试种质群体结构引起的伪关联的概率,进而有效提高了关联分析的精确性。
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近年来,关联分析已成功应用于植物争论。顾竟等(2011)接受GLM一般线性模型,利用59个SSR标记对豌豆的19个形态性状进行关联分析,结果显示SSR位点间有较高的多态性和确定程度的连锁不平衡,一共检测出32个SSR标记位点与14个表型性状相关联,其中有一些SSR标记与两个或多个形态性状相关联。Ehrenreich等(2007)对来自中欧的96份拟南芥种质群体进行分析,并使用MLM混合线性模型的关联作图方法鉴定出3个与分枝变异显著关联的位点。Zhang等(2010)和Price等(2010)认为在进行全基因组关联分析中MLM模型比GLM模型更适合。赖勇等(2013)对113份大麦亲本材料进行了SSR遗传多样性分析及群体遗传结构分析,结果发觉使用MLM模型鉴定的显著关联位点要明显比GLM模型鉴定的少3个,两种模型分析中分别查找到了9个与株高、穗长、芒长、穗粒数相关联,6个与株高、芒长和小穗着生密度相关联的标记。
,分别找到了7个和6个与果实、叶片相关的标记,其中MLM分析检测到的5个SSR标记同样也在GLM分析中所检测到,标记751与叶片的AsA含量有关,只有在MLM模型分析中检测到;GLM模型分析检测到与叶片的AsA含量有关的标记761,却在MLM模型分析中未检测到。
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MLM模型分析结果比GLM模型分析结果要少1个,主要缘由是GLM分析中只考虑群体结构Q值对关联分析的影响,而MLM分析中不仅考虑了Q值,还考虑到了亲缘关系K值对关联分析的影响,提高了关联分析的精确性,使结果更加精确牢靠。
4、结论
本争论中解析了野生毛花猕猴桃AsA含量关联位点内各等位变异的表型效应,在AsA含量的表型数据和分子标记检测得到的基因型数据之间用特定的等位变异建立起联系,发掘了与果实及叶片AsA含量关联的优异标记SSR位点UDK96-040、UDK96-053、UDK97-408、UDK97-414和Ke227等。

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