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一种抗虫低酚棉花品种的育种方法技术

花匠小妙招
2025-01-04 06:26

本发明专利技术提供一种抗虫低酚棉花品种的育种方法，属于基因工程技术领域，包括对CAD1‑A基因进行克隆，得CAD1‑A‑1质粒；构建CAD1‑A基因的RNAi表达载体；采用根癌农杆菌介导法对所述转Bt基因抗虫棉的胚性愈伤组织进行遗传转化；其中，RNAi表达载体中CAD1‑A基因由α‑球蛋白启动子驱动，α‑球蛋白启动子用Enh Ⅰ增强子进行修饰。该方法能够抑制Bt基因启动子及CAD1‑A基因种子特殊启动子的甲基化，从而抑制复合转基因作物中Bt基因转录水平的显著降低，促进CAD1‑A基因转录水平的降低；能够减少对胚性愈伤组织的毒害，抑制转化细胞的程序化死亡，增加转化频率。

A breeding method of insect resistant and low phenol cotton variety

【技术实现步骤摘要】
一种抗虫低酚棉花品种的育种方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种抗虫低酚棉花品种的育种方法。
技术介绍
棉酚对细菌、真菌、昆虫等均具有毒性，是棉花防御机制的重要组成部分。然而，棉酚容易破坏人和单胃动物的胃粘膜，引起消化功能的紊乱，这成为长期阻碍人们更好地开发和利用棉籽的重要原因。虽然棉酚可经物理、化学等方法去除，但工艺复杂、投资大、耗能多、成本高，而且经过这些方法处理的棉籽饼，营养成分都有不同程度的丢失，其食用安全性也会降低。因此，世界各国的育种专家相继展开了低酚棉育种工作，希望通过遗传育种的手段能够选育出低酚的棉花新品种，使棉花不仅能生产纤维，还能生产可供直接利用的棉籽蛋白和棉籽油，成为棉粮油三位一体的新型作物。但是由于常规育种获得的低酚棉品种植株没有棉酚而导致抗虫性差，易受叶食性害虫以及鼠、兔的危害，在应用推广上受到了极大的限制。因此，后来的育种目标自然就集中在了棉株高酚而降低棉籽的棉酚含量的品种选育。一些研究员也尝试将外源Bt基因导入低酚棉来提高低酚棉的抗虫性，但是，直到目前为止，仍未看到具有显性低酚性状的转基因抗虫棉选育成功的报道。现有技术如授权公告号为CN103493728B的中国专利技术专利，涉及一种抗虫低酚彩棉不育系选育及杂交种育种方法，该方法用低酚棉鲁棉12号为母本与抗虫棉鲁棉研21号为父本杂交配组，选择F2代群体中子叶、茎、叶均无酚的植株，连续自交种植3～4代，育成低酚棉系8HN538，用抗虫的核不育系品种鲁RH-1为母本与深棕色低酚彩棉亲本00S17为父本杂交配组，保留...

【技术保护点】
1.一种抗虫低酚棉花品种的育种方法，利用RNAi技术沉默转Bt基因抗虫棉中的杜松烯合成酶基因CAD1-A，制得复合转基因棉花品种，具体步骤包括：/nS1、对所述CAD1-A基因进行克隆，得CAD1-A-1质粒；/nS2、构建CAD1-A基因的RNAi表达载体；/nS3、采用根癌农杆菌介导法对所述转Bt基因抗虫棉的胚性愈伤组织进行遗传转化；/n其中，所述步骤S2中RNAi表达载体中CAD1-A基因由α-球蛋白启动子驱动，所述α-球蛋白启动子用EnhⅠ增强子进行修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗虫低酚棉花品种的育种方法，利用RNAi技术沉默转Bt基因抗虫棉中的杜松烯合成酶基因CAD1-A，制得复合转基因棉花品种，具体步骤包括：
S1、对所述CAD1-A基因进行克隆，得CAD1-A-1质粒；
S2、构建CAD1-A基因的RNAi表达载体；
S3、采用根癌农杆菌介导法对所述转Bt基因抗虫棉的胚性愈伤组织进行遗传转化；
其中，所述步骤S2中RNAi表达载体中CAD1-A基因由α-球蛋白启动子驱动，所述α-球蛋白启动子用EnhⅠ增强子进行修饰。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：利用所述α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体构建所述CAD1-A基因的RNAi表达载体。

3.根据权利要求2所述的育种方法，其特征在于：所述步骤S2的构建方法为：
1)使所述α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体的部分GUS缺失，得空白RNAi表达载体；
2)向1)中所得载体插入CAD1-A基因正向序列，得CAD1-A-R的RNAi表达载体；
3)向2)中所得载体插入CAD1-A基因反向序列，得CAD1-A基因的RNAi表达载体。

4.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于：所述步骤1)中空白RNAi表达载体的制备方法，包含：
a、对所述GUS基因的内含子Intron1进行PCR扩增，回收纯化，得目的片段Ⅰ；
b、使用SacI对所述植物双元表达载体进行酶切，回收纯化，得目的片段Ⅱ；
c、使用XhoI对目的片段Ⅱ进行酶切，回收纯化，得目的片段Ⅲ；

【专利技术属性】
技术研发人员：米换房，权月伟，唐光雷，翟雷霞，李继军，李文蕾，
申请(专利权)人：邯郸市农业科学院，
类型：发明
国别省市：河北;13