首页 > 分享 > 土壤微生物的分离及鉴定

土壤微生物的分离及鉴定

花匠小妙招
2025-01-04 12:42

该【土壤微生物的分离及鉴定】是由【老狐狸】上传分享，文档一共【37】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【土壤微生物的分离及鉴定】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。35
微生物试验报告
——土壤微生物的分别筛选纯化与鉴定
山东大学生命科学学院2023级生物基地
〔周一下午*组〕
***
同组者:指导教师:
时间:2023年12月9日——2023年12月21日
摘要
利用分别纯化微生物的根本操作技术对土壤中的微生物进展分别与纯化,通过对菌落形态的观看、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果,通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》比照种属特征最终判断所分别纯化的细菌所属的属。
关键词
土壤微生物,分别鉴定,生理生化,酶活测定,《伯杰氏系统细菌学手册》
前言
土壤是微生物的良好生境,土壤中有多种类群的微生物,它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用,对农业生产和环境保护有着不行无视的影响。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说,在土壤外表,由于日光照耀及枯燥等因素的影响,微生物不易生存,离地表10cm~30cm的土层中菌数最多,随土层加深,菌数削减。
通过土壤微生物的分别纯化,得到纯种,再进展相关的试验,如:菌落观看、革兰氏染色、芽孢染色、生理生化试验等,依据试验结果,查阅《伯杰氏系统细菌学手册》确定所分别纯化细菌所属的属。在此过程中生疏相关操作。

学会设计试验方案;
分别目的菌,把握几种常用的分别纯化微生物的根本操作技术;
35
复习稳固显微镜使用方法;
复习配制培育基的一般方法和步骤、复习各种灭菌方法和操作步骤;
复习、把握细菌稀释分别、划线分别等技术。复板倾注法和斜面接种技术,了解培育细菌的培育条件和培育时间。复板菌落计数法;
复习把握细菌的简洁染色、鞭毛染色、革兰氏染色的根本原理和操作方法,复习霉菌的小室培育法;
复习生理生化试验的原理及操作方法,学习测定酶活的试验方法;
学会利用《伯杰氏系统细菌学手册》对所分别纯化的细菌定属。
产果胶酶菌株的筛选
配制以果胶为唯一碳源的筛选培育基,在该培育基上,只有能分解利用果胶的菌株才能够生长,依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红〔CongoRed,简称CR〕是一种染料,它可与果胶形成红色复合物,但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反响,在含有果胶的培育基中参与刚果红时,刚果红能与培育基中的果胶形成红色复合物。当果胶被果胶分解菌分泌的果胶酶分解后,刚果红-果胶的复合物就将无法形成,从而在培育基中形成以果胶分解菌为中心的透亮圈,这样我们就可以通过是否产生透亮圈来筛选果胶分解菌。
产几丁质菌株的筛选
35
配制以几丁质为唯一碳源的筛选培育基,在该培育基上,只有能分解利用几丁质的菌株才能够生长,依此来从土壤中筛选出能够产几丁质酶的菌株。由于几丁质不能溶解于培育基,故在固体培育基平板上表现为浑浊,假设菌株能够产生几丁质酶,则在培育基中形成以菌落为中心的透亮圈,因此可以通过是否产生透亮圈来筛选几丁质酶产生菌株。
为筛选到真菌,承受参与链霉素来抑制细菌生长。

通过培育的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培育基上,经过
生长生殖形成几百万个聚拢在一起的肉眼可见的菌落。平板培育基含
有细菌生长所需要的养分成分,当取自不同来源的样品接种于培育基
上,在37℃温度下培育,1—2天内每一菌体即能通过很屡次细胞分
裂而进展生殖,形成一个可见的细胞群体的集落,称为菌落。每一种
细菌所形成的菌落都有它自己的特点。因此,可通过平板培育来检查环境中细菌的数量和类型。
单染色观看个体形态
单染色即用单纯的种染料进展染色,多数承受美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。此法仅能显示细胞的外部形态,而不能区分其内部构造。染色前必需将细胞固定,其目的是杀死细菌,并使它粘附在载玻片上。此外,还可以增加菌体对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态,防止细胞膨胀或收缩。
35
革兰氏染色法
革兰氏染色反响是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色法不仅能观看到细菌的形态,而且还可将全部细菌区分为两大类:染色反响呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示:染色反响呈红色〔复染颜色〕的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反响,是由于它们细胞壁的成分和构造不同而造成的。
革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料初染液;媒染剂;脱色剂和复染液。碱性染料初染的作用像在细菌的单染色法根本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进展脱色,不同类型的细胞脱色反响不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精。复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞照旧保持初染的颜色,从而将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液是番红。
芽孢染色
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到确定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体构造,也被称为内生孢子〔endospore〕,通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的外形,着生部位、芽孢囊是否膨大等特征都是细菌分类的重要指标。与正常细孢或菌体相比,芽
35
孢壁厚、透性低而不易着色,但是,芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点,首先用着色力气较强的染料〔如孔雀绿或石碳酸复红〕在加热条件下进展染色,此染料不仅可以进入菌体,而且也可以进入芽孢,进入菌体的染料可经水洗脱色,而进入芽孢的染料则照旧保存。再用比照度大的复染剂〔如番红液〕染色后,菌体染上复染剂颜色,而芽孢仍为原来的颜色,这样就可以将两者区分开来。
细菌运动性检测——半固体穿刺法
将细菌穿刺培育于半固体培育基中,经培育后,无鞭毛的细菌沿穿刺线生长,穿刺线清楚;有鞭毛的细菌沿穿刺线向四周集中,穿刺线模糊不清。
鞭毛染色
鞭毛是细菌的运动“器官”,一般细菌的鞭毛都格外纤细。鞭毛的
有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。依据鞭毛的特征,
可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭
毛菌。鞭毛直径一般为10~30nm,只有用电镜才能直接观看到。
在一般光学显微镜的区分力限度以外,故需要用特别的鞭毛染色法,
才能看到。首先用媒染剂〔如单宁酸或明矾钾〕处理,使媒染剂附着
在鞭毛上使其加粗,然后用碱性复红〔Gray氏染色法〕、碱性复品
红〔Leifson氏染色法〕、硝酸银〔West氏染色法〕或结晶紫〔Difco
氏染色法〕进展染色。
在显微镜下观看细菌的运动性,也可以初步推断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观看细菌的运动性。观看时,要适当减
35
弱光线,增加反差,假设光线很强,细菌和四周的液体就难以区分。
霉菌的形态观看
霉菌菌丝体由基内菌丝、气生菌丝和生殖菌丝组成,其菌丝比细菌及放线菌粗几倍到几十倍。可以实行直接制片和透亮胶带法观看,也可以实行载玻片培育观看法,通过无菌操作将薄层培育基琼脂置于载玻片上,接种后盖上盖玻片培育,使菌丝体在盖玻片和载玻片之间的培育基中生长,将培育物直接置于显微镜下可观看到霉菌自然生长状态并可连续观看不同发育期的菌体构造特征变化。对霉菌可利用乳酸石炭酸棉蓝染液进展染色,盖上盖玻片后制成霉菌制片镜检。石炭酸可以杀死菌体及孢子并可防腐,乳酸可保持菌体不变形,棉蓝使菌体着色。同时,这种霉菌制片不易枯燥,能防止孢子飞散,用树胶封固后可制成永久标本长期保存。
微生物数量的测定
显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别
的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)-显微镜下直接
有两种规格,一种是一个大方格分成25个中方格,而每个中方格
又分成16个小方格;另一种是一个大方格分成16个中方格,而
计数的一种简便、快速、直观的方法。本试验用血球计数板进展显微镜直接计数。血细胞计数板构造如图2。计数室的刻度一般
每个中方格又分成25个小方格(图1),但无论是哪一种规格的计数板,每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长
为1mm,则每一个大方格的面积为1mm2,盖上盖玻片后,盖玻片
35
计数时,通常数五个中方格的总菌数,然后求得每个中方格
的平均值,再乘上25或16,就得出一个大方格中的总菌数,然
,(万分之一毫升)。
后再换算成1ml菌液中的总菌数。
25个中方格的计数板,设5个中方格中的总菌数为A,菌液
稀释倍数为B,则:1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104
-
×B=50000A·B〔个〕同理,16个中方格的计数板,1mL菌液中的
总菌数=A/5×16×104×B=32023A·B〔个〕。
图1
血球计数板构造示意图
生理生化
在全部生活细胞中存在的全部生物化学反响称之为代谢。代谢过程主要是酶促反响过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内,称为胞内酶〔endoenzymes〕.很多细菌产生胞外酶(exoenzymes),这些酶从细胞中释放出来,以催化细胞外的化学反响。各种微生物具有不同的酶系统,所以它们能利用的底物不同,或虽利用一样的底物但产生的
35
代谢产物却不同,因此可以利用各种生理生化反响来鉴别不同的细菌,尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中,生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下:
大分子水解试验:
微生物对大分子如淀粉、蛋白质和油脂不能直接利用,必需依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后才能被微生物吸取利用。微生物的胞外酶〔如淀粉酶、脂肪酶等〕主要为水解酶,通过加水裂解大分子物质为较小化合物,使其能被运输至细胞内。将大分子物质分解的过程可以通过观看细菌菌落四周的物质变化来证明。淀粉遇碘液会产生蓝色,但细菌水解淀粉的区域,用碘液测定时,不再产生蓝色,说明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可以转变培育基的PH,使PH降低,参与培育基的中性红指示剂会使培育基从淡红色转变为深红色,说明细胞外存在脂肪酶。
糖发酵试验:
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反响。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的力气上有很大差异,有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体,有些细菌只产酸不产气。发酵培育基含有蛋白胨、指示剂〔溴甲酚紫〕、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时,溴甲酚紫指示剂可由紫色〔〕转变为黄色〔〕。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
IMViC试验
35
吲哚试验:
用来检测吲哚的产生,有些细菌产生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸,产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合,形成红色的玫瑰吲哚。但并非全部的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的力气,因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。
吲哚对二甲基氨基苯甲醛反响:
甲基红试验:
用来检测由葡萄糖产生的有机酸,如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时,培育基就会变酸,使参与培育基中的甲基红指示剂由橙黄色〔〕转变为红色〔〕,即甲基红反响。
酶活测定
DNS法
酶活力单位定义为:
产果胶酶的菌株:规定每ml果胶酶液降解果胶底物每分钟产生
1μg复原糖为1个酶活单位。
产几丁质酶的真菌:在选定反响条件下,每分钟释放相当于1molN-乙酰氨基葡萄糖(NAG)NAG所需酶量为1个酶活力单位(U)。
甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有复原性末端的
寡糖和有复原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反响。反响液颜色的强度与酶解产生的复原糖量成正比,而复原糖的
35