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球孢白僵菌Snef23杀线虫活性物质的分离、合成及对南方根结线虫的毒力评估

花匠小妙招
2025-01-05 14:09

刘晓宇，陈立杰，邢志富，王海明，段玉玺

（沈阳农业大学植物保护学院/北方线虫研究所，沈阳110161）

植物寄生线虫种类繁多，已报道的植物寄生线虫有200 多属、5000 余种，其中南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是当前难以解决的、对设施蔬菜危害严重的植物病害。病害发生后，减产约10%，严重的高达75%甚至绝收，每年给世界主要农作物造成相当于1000 亿美元的损失[1-2]。目前，生产上根结线虫病的防治仍以化学农药为主，农户为了追求高产而过量使用化学农药，导致环境污染、线虫抗药性和残留超标等问题日益突出。随着环境保护、食品安全及农业可持续发展的需要，研发环境友好型的生物源杀线虫剂势在必行。虫生真菌因兼具控制害虫和维护生态环境的优点成为该方向的研究热点。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是研究与应用最多的杀虫真菌[3-4]。目前我国登记注册的球孢白僵菌产品共24 个，主要用于蓟马、粉虱、蚜虫等蔬菜害虫的防治，未见线虫病害防治产品的注册。沈阳农业大学北方线虫研究所致力于功能生防菌的筛选，获得多株具有杀线虫活力的球孢白僵菌，其中球孢白僵菌Snef23 的次生代谢物对腐烂茎线虫、大豆胞囊线虫、南方根结线虫的致死率均达80%以上，具有很好的生防潜力[5-10]。

目前微生物农药多为活菌制剂，田间防治效果常受到定植环境、储存时长和菌株退化等因素的影响，因此解决微生物农药防效稳定性的措施之一就是通过化学方法分离和解析菌株次生代谢产物中的活性化合物，一方面以活性化合物的含量作为微生物农药药效的评测标准，另一方面也可以将活性化合物的结构作为先导化合物开发设计新型微生物源杀线虫剂。本研究利用活性追踪法，分离纯化了球孢白僵菌Snef23 的代谢产物中活性化合物，经质谱和核磁波谱解析活性化合物的结构，进一步化学合成了该化合物，最后通过室内生测和盆栽试验评估了该化合物对南方根结线虫的毒力和防治效果，为球孢白僵菌Snef23 的推广应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试球孢白僵菌Snef23，由沈阳农业大学北方线虫研究所分离并保存。供试南方根结线虫2 龄幼虫（J2），在温室内用感病番茄（L402）单卵块繁殖，挑取卵囊，0.5%NaClO 处理3 min 后无菌水冲洗3 次，于25℃培养箱孵化出J2 收集备用[11]，用于室内生测和盆栽试验。供试番茄（Solanum lycopersicum Mill.）品种为L402，由辽宁省农业科学院蔬菜研究所提供。

供试苯乙烯为安耐吉化学技术有限公司生产，乙酰氨基丙二酸二乙酯和碘化钾为阿拉丁试剂公司生产。其他试剂均为分析纯并按常规法进行干燥。

1.2 方法

1.2.1 发酵液中活性物质的分离纯化和活性检测[10]球孢白僵菌Snef23 发酵液[3]过滤去除菌丝体，上清液旋蒸浓缩至1/4，加入4 倍体积无水乙醇，4℃静置24h，离心取上清。减压浓缩，冻干后冷藏备用。

取冻干粉末用去离子水配成10%浓度的溶液，上样D101 大孔树脂（Φ=2cm），分别用0%、30%、50%、70%、90%乙醇水溶液（V/V）进行洗脱，流速为1.5～2.0BV·h-1，每个梯度洗脱约3～4 倍柱体积，各分3 部分收集，最终可获得15 个级分，旋蒸浓缩后冻干，配制1mg·mL-1溶液。

以南方根结线虫J2 作为靶标，测定分离纯化过程中各级分的活性，寻找活性最高的级分。贝氏小皿经高温灭菌后分别加入50μL 线虫悬浮液（约含50 条J2）和1mg·mL-1的待测液1mL，以无菌水作为空白对照，每个处理重复3 次。将贝氏小皿放入（25±2）℃恒温培养箱中培养24h，观察线虫的死亡情况，并计算线虫死亡率和校正死亡率。

1.2.2 发酵液中活性化合物的结构鉴定浓缩活性最高的级分溶液，利用制备型薄层层析板获得其中活性最高的化合物。在IonSpec 7.0T 傅利叶变换粒子回旋共振质谱仪上测定质谱。

将 10 mg 样品溶于 0.5 mL DMSO-d6。在 Bruker AV 600 MHz spectrometer 上测定13C NMR 和1HNMR。

1.2.3 活性化合物的化学合成[12]根据菌株发酵液中活性化合物的结构，利用文献[12]中的方法合成活性化合物。

1.2.4 活性化合物对根结线虫的毒力测定将化合物溶于甲醇，加入少量吐温80 助溶，用无菌蒸馏水制成1.0×104mg·L-1的母液。吸取母液加入灭菌的小皿中，以无菌水定容至800μL，混匀后加入200μL 线虫悬浮液（内含约 50 条 J2）。使活性化合物的测定终浓度分别为 100，200，400，800，1000mg·L-1。每个处理重复 5 次，分别以1%，2%，4%，8%，10%的甲醇水溶液为对照。将贝氏小皿放入（25±2）℃恒温培养箱中培养，在24h 和48h后进行活体显微镜检查，记录供试线虫总数和死亡总数，计算半致死浓度（LC50）[13]。

1.2.5 活性化合物促生防病盆栽试验[14]2019 年5 月进行盆栽试验。番茄种子经1%NaClO 消毒后播种于32孔穴育苗盘育苗。准备10cm×10cm 的营养钵，每个营养钵中装入500g 灭菌的混合土壤，土∶基质∶沙（m/m/m）=2∶1∶1，当番茄苗长到2 叶1 心时，将长势一致的番茄苗移栽到营养钵，每钵1 株。培养条件为：相对湿度65%，温度（28±2）℃，光照不少于16h。在移栽2d 后对番茄苗进行试验处理。将化合物溶于甲醇，加入少量吐温80 助溶，用无菌蒸馏水配置梯度浓度处理液。试验共设置6 个处理：只接南方根结线虫作为对照组（CK，0mg·L-1+J2）；100mg·L-1浓度处理（100mg·mL-1+J2）；200mg·L-1浓度处理（200mg·L-1+J2）；400mg·L-1浓度处理（400mg·L-1+J2）；800mg·L-1浓度处理（800 mg·L-1+J2）；1000mg·L-1浓度处理（1000mg·L-1+J2）。每株番茄苗接种 2000 条根结线虫J2。接种后，立刻向各株番茄苗灌根施用处理液50mL，每个处理重复10 次。所有处理均随机放置在温室的架子上，每2d 各浇无菌水50mL，常规培养。

处理30d 后，每处理随机选取5 棵番茄植株连根挖出，保持根系完整。用流水将根系的泥沙冲洗干净后，测量番茄植株的株高、根长、根鲜重和根干重[15-16]；同时，检测每株根上的根结数量，并计算根结减退率[17]。

1.3 数据处理与分析

运用Microsoft Excel 和SPSS 20.0 软件进行数据统计分析，并采用Duncan's 新复极差法进行差异显着性检验。

2 结果与分析

2.1 活性化合物的分离纯化和活性检测

球孢白僵菌Snef23 发酵液的醇沉上清部分经大孔树脂吸附，共收集15 个级分，活性成分主要集中在级分5 中，24h 对南方根结线虫的校正死亡率为50.8%，其余级分的校正死亡率均小于30%。级分5 经薄层层析板分析，以 CH2Cl2∶CH3OH=9∶1 为展层剂，碘熏蒸为检测手段，获得 3 个含量较高的化合物，Snef23-E5-1、Snef23-E5-2 和 Snef23-E5-3，Rf 值分别为 0.74，0.23，0.10。利用制备型薄层层析板制备富集 3 个化合物。以南方根结线虫J2 为靶标，1000mg·L-1的3 个化合物对南方根结线虫J2 的校正死亡率分别为57.69%、11.31%和20.56%，继续利用制备型薄层层析大量制备Snef23-E5-1，获得11.8mg 用于结构鉴定。

2.2 活性化合物的结构鉴定

2.2.1 质谱分析化合物的质谱分析如图1，分子离子峰m/z 222.1097[M+H]+，244.0934 为[M+Na]+，465.1914 为[2M+Na]+，260.0697 为[M+K]+。结合13C NMR（图2a）和1H NMR（图3a）谱图的分析，最终确定活性物质的分子式为C12H15NO3。

图1 Snef23-E5-1 的质谱图Figure 1 The MS spectrogram of Snef23-E5-1

2.2.2 核磁共振波谱分析图2a 是 Snef23-E5-1 的13C NMR 图谱。126.51，127.71，128.16，142.86ppm 是单取代苯环的特征峰，40.97ppm 和57.49ppm 为叔碳的吸收峰；18.62 和22.30ppm 为甲基吸收峰。173.02ppm 和169.12ppm 为羰基吸收峰。

图2 Snef23-E5-1 的 13C NMR 图谱（a.Snef23-E5-1；b.化学合成 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸）Figure 2 The 13C NMR spectrogram of Snef23-E5-1（a.Snef23-E5-1; b.Chemically synthesized N-acetyl-βmethyl-phenylalanine）

图3a 为 Snef23-E5-1 的1H NMR 图谱。1.204ppm 和 1.216ppm（d,J=7.2Hz,3H）为 β-甲基吸收峰；1.703ppm和 1.711ppm（d, J=4.8Hz, 3H）为乙酰基中甲基的吸收峰；3.065～3.115ppm（m, 1H）和 4.440～4.469ppm（t, J=8.4,17.4Hz）为化合物中 2 个叔氢的吸收峰；7.232～7.286ppm （m, 5H）为苯环上 5 个 H 的吸收峰；7.942ppm 和7.957ppm（d,J=9.0Hz）为仲胺氢的吸收峰。

图3 Snef23-E5-1 的 1H NMR 图谱（a.Snef23-E5-1；b.化学合成 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸）Figure 3 The 1H NMR spectrogram of Snef23-E5-1（a.Snef23-E5-1; b.Chemically synthesized）

综合化合物的质谱和核磁共振图谱的检测结果，最终确定该化合物为N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸，其结构为：

2.3 活性化合物的合成

N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸的合成工艺见图4。所得产物为白色固体粉末，产率为89.6%，熔点为180～181℃。其13C NMR 和1H NMR 如图2b 和图3b。与发酵液提取获得的Snef23-E5-1 的13C NMR 图2a 和1H NMR图3a 对比，两者完全一致。化学合成的N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸可用于进一步的活性测试。

图4 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸的合成路线Figure 4 Synthetic route of N-acetyl-β-methyl-phenylalanine

2.4 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸对根结线虫的毒力

由表1 可知，24h 和 48h 的 LC50分别为 1018.467mg·L-1和 614.606mg·L-1，结果表明 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸对J2 具有中等活性[21]，是Snef23 发酵液中的主要活性成分。

表1 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸对南方根结线虫 J2 的毒力测定结果Table 1 Toxicity effect of N-acetyl-β-methyl-phenylalanine on J2 of Meloidogyne incognita

2.5 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸的促生防病效果

由表2 和图6 可知，灌根施药30d 后，各处理组与对照组的番茄生长具有差异。当处理液浓度为1000 mg·L-1时，根结减退率高达68.83%。在30d 的生长期中，番茄苗接种J2 后，根部受到线虫侵染，产生根结，根部发育受到损伤，因此对照的根最短，各处理的株高、根长、根鲜重和根干重数值随处理液浓度的增大而增大，当处理液浓度为1000mg·L-1时，分别提高29.67%、74.60%、35.7%和10.5%，差异性显着，说明各处理经N-乙酰氨基-β-甲基苯丙氨酸处理后根结发生量减少，但株高、根长、根鲜重、干重有明显增加，说明该化合物不仅有杀线虫活性，还有促生作用。

表2 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸对番茄植株生长和根结形成的影响（30 d）Table 2 Effect of N-acetyl-β-methyl-phenylalanine on plant growth of tomato and root knot formation of Meloidogyne incognita 30 days after inoculation

图6 盆栽试验中不同处理后番茄根系的症状表现（30d）Figure 6 Symptom performance of the tomato roots in 30 days after different treatments in the pot experiment

3 讨论与结论

白僵菌是继转基因抗虫棉BT 毒蛋白之后最有机会实现现代产业化的新型绿色生物农药[22]。目前研究最多并被商品化作为杀虫剂的是球孢白僵菌[3,23-26]，它的防治对象包括松毛虫 (Dendrolimus spp)、蛴螬(Holotrichia diomphalia)、茶小绿叶蝉(Empoasca flavescens) 、玉米螟(Ostrinia palustralis)等。球孢白僵菌在线虫防治方面的研究和报道相对较少，仍处于菌株筛选[6,27]、防效测试[5,9-10]和代谢物杀线虫机理初探[8,28]的阶段。作为生物农药，球孢白僵菌在生产实践应用中对环境的要求比较高，需要根据使用地区的虫害类别、季节和地理位置等因素来调整施放量，恶劣的环境和不良的定植环境容易使白僵菌制剂失去活性，这也是所有微生物农药在应用方面的共同缺陷。解析微生物次生代谢产物中的有效化合物组成是解决微生物农药稳定性的有效办法之一。本研究从对南方根结线虫有高毒力的球孢白僵菌株Snef23 的次生代谢产物中分离获得了化合物N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸，其对南方根结线虫J2 具有毒杀作用。室内盆栽试验中可显着降低根结指数，促进植株生长。1000 mg·L-1的N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸根结减退率可达68.83%，株高、根长、根鲜重和根干重分别增加29.67%、74.60%、35.71%和10.53%。

微生物的次生代谢产物是生物农药开发的重要宝库。目前，已确定结构的天然产物数量超过一百万，来源于微生物的活性化合物大约22000～23000 个[18]，这些化合物中有些毒性大或活性不够高而无法直接应用。20世纪80 年代初阿维菌素（avermectin，AVM）的发现是微生物源天然产物农药研究的划时代突破[19]，也是目前商品化最成功的一种生物农药。阿维菌素的成功不仅在于它的独立活性，还在于形成了基于相同化合物骨架而合成的系列衍生物，如伊维菌素（ivermectin）、道拉菌素（doramectin）和埃玛菌素（emamectin）等[20]。因此，如果能用化学方法合成出天然有效成分，或者以天然产物为先导化合物进行结构修饰，提高活性而降低毒性，那么许多天然产物活性成分都有可能被开发成新型生物农药。本研究以苯乙烯和乙酰氨基丙二酸二乙酯为原料，经加成、取代、水解和脱羧等化学反应合成了N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸，产率为89.6%。虽然该化合物对根结线虫仅具有中等毒杀能力，但是它可以作为先导化合物，通过结构修饰提高活性，具有进一步研究的潜力，为新型微生物源杀线虫剂的开发设计提供借鉴。

伴随着设施蔬菜种植面积的逐渐扩大，根结线虫病害也逐年加剧，获得安全、高效、低毒的杀线虫药剂已经迫在眉睫。从微生物次生代谢物中获得具有杀线虫活性的化合物，明确作用机理，开展仿生合成是新型药剂研究开发的趋势。球孢白僵菌株Snef23 的次生代谢产物对南方根结线虫具有高毒力，它的活性化合物分离、提纯和结构解析的工作尚需继续，并深入各化合物的杀线虫机理研究，为球孢白僵菌Snef23 的推广应用提供理论依据和物质基础。