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一种南方根结线虫活体卵的分离方法与流程

花匠小妙招
2024-12-08 13:08

一种南方根结线虫活体卵的分离方法与流程

[0001]
本发明涉及农业植物保护领域，尤其涉及一种南方根结线虫活体卵的分离方法。

背景技术：

[0002]
根结线虫卵聚集在一起，以卵块包被的胶质存在，实验过程中往往要对根结线虫卵及二龄幼虫的孵化、发育及生物学特性进行研究，是重要的实验应用材料，但是采集的卵块很难进行分离成单个的卵，本技术主要对南方根结线虫卵进行高效分离，获得高纯度无杂质的线虫卵粒，并保证其活性，解决这一难题，为相关实验研究过程中提供应用材料。
[0003]
根结线虫病主要由南方根结线虫(meloidogyne incognita)侵染引起的，其发生范围包括我国各地区的果树蔬菜种植区。在根结线虫病害发生的种植区，产量损失一般达30％-50％，严重的达70％以上，有的甚至绝收；据估算，我国每年因根结线虫病(以南方根结线虫病为主)引起的损失高达500亿人民币。南方根结线虫专性寄生于植物根系，在破坏根组织正常功能形态后，可影响种苗根部对养分和水分的吸收，导致植株矮小，叶片枯黄，坐果少，果小畸形，进而造成植株营养生长和生殖生长的抑制，甚至死亡。南方根结线虫的侵染会对植株根系造成伤口，有利于其他植物病原物的复合侵染，植株对病原真菌和细菌的易感性增强，在种植过程中，农业生产经营者往往面临的是更严重的复合病害发生。目前，涉及对南方根结线虫生物学，发生规律及综合防治等方面的研究需要对根结线虫的数量、种群密度进行准确评估，其中卵的数量是一个重要的指标，这对根结线虫病害的治理具有重要的现实意义。
[0004]
根结线虫的分离方法较多，有贝曼漏斗法、浅盘法、离心法、离心漂浮法及淘洗染色方法，这些方法各有优缺点，其中贝曼漏斗法和浅盘法只能分离土壤中活动的2龄线虫幼虫，但不能分离卵；离心法、离心漂浮法和淘洗染色方法只能分离土壤中线虫幼虫及分散的卵，不能分离附着在根系上的卵囊，而且往往不同种类线虫种类的卵个体混合存在，不能保证卵是活体。而根结线虫多以卵囊形式附着在根系表面或土壤颗粒上度过不利环境，所以传统的方法均不能准确评估根结线虫数量情况。

技术实现要素：

[0005]
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种南方根结线虫活体卵的分离方法。
[0006]
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
[0007]
本发明包括以下步骤：
[0008]
①
采集植物病根后，将其在实验室进行保湿放置；
[0009]
②
将植物根组织进行冲洗，在体视镜下，用镊子挑取足量的线虫卵囊，并将其置于含有无菌水中的离心管中；
[0010]
③
将含有线虫卵囊的离心管进行旋转离心，用移液器充分移除上清液；
[0011]
④
加入次氯酸钠溶液处理线虫卵囊，期间将样品在涡旋震荡器上反复震荡；
[0012]
⑤
将样品旋转离心，后用移液枪吸取上清液，弃去；
[0013]
⑥
加入无菌水，涡旋震荡，使卵囊样品充分混匀，旋转离心，弃上清液；
[0014]
⑦
重复步骤
⑥
，用无菌水将线虫卵囊样品充分洗涤3-5遍；
[0015]
⑧
加入无菌水，将样品充分混匀后于实验台上静置；
[0016]
⑨
用移液器吸取离心管上层的线虫卵粒悬浮液，并将其移至新的离心管中；
[0017]
⑩
体视镜下对线虫卵粒进行计数，并计算其对应的浓度；
[0018]
根据后续实验需求，移取相应体积的卵粒悬浮液进行其它条件处理和孵化实验。
[0019]
优选的，所述步骤
②
和步骤
③
的离心管均为1.5ml离心管。
[0020]
优选的，所述步骤
③
和步骤
⑤
的旋转离心转速均为1600rpm，离心时间均为2分钟。
[0021]
优选的，所述步骤
④
的次氯酸钠溶液为1ml且有效浓度为0.3％。
[0022]
优选的，所述步骤
①
的保湿放置时间为12h～72h。
[0023]
本发明的有益效果在于：
[0024]
本发明是一种南方根结线虫活体卵的分离方法，与现有技术相比，本发明的方法将剥离附着在根系表面上根结线虫卵囊进行静止孵育、naocl离解、清洗、震荡、离心等处理，可以分离出纯净、单一种群分散的南方根结线虫卵粒，同时保证了卵的活性，具有推广应用的价值。
附图说明
[0025]
图1是不同的抚育时间南方根结线虫卵囊离解的数量图；
[0026]
图2是次氯酸钠不同长时间处理卵囊的孵化数量图。
具体实施方式
[0027]
下面结合附图对本发明作进一步说明：
[0028]
实施例1：南方根结线虫卵囊不同的抚育时间对卵囊离解影响
[0029]
1)材料方法：采集南方根结线虫侵染的南瓜病根，并将其保湿置于28℃条件下；分别在12、24、48和72h后，剪取少量根系组织用自来水彻底冲洗干净，；在体视镜下，分别从不同时间处理的病根中，用镊子挑取大小一致10个(乳白色)南方根结线虫卵囊，其中每个处理包含5个独立的技术重复(replicate)；将挑取的线虫卵囊置于含有500μl无菌水的1.5ml离心管中；1600rpm转速下离心2min后，用移液器充分移除上清；加入1ml且有效浓度为0.3％的次氯酸钠(naclo)溶液处理线虫卵囊2min，期间将样品在涡旋震荡器上反复震荡；1600rpm离心2min，弃掉上清，并用无菌水充分洗涤样品3次；加入500μl无菌水，将各样品混匀后于实验台上静置5-10秒后，取10μl上层卵粒悬浮液，在体视镜下对线虫卵粒进行计数(见图1)；实验包含三次生物学重复。
[0030]
2)超过48h的静置可显著增加南方根结线虫卵囊离解数量，为研究自然孵育时间对南方根结线虫卵囊离解的影响，通过将南瓜病根在28℃条件下静置孵育12、24、48和72h，然后借助有效浓度为0.3％的次氯酸钠溶液离解线虫卵囊。实验结果显示，随着南瓜病根自然孵育时间的延长，线虫卵囊受次氯酸钠溶液离解的效率呈显著增强的趋势(one-way analysis ofvariance；p<0.01)，经过12、24、48和72h孵育，其离解卵粒数量分别为14.4
±
1.63、23.4
±
1.21、43.6
±
1.36和46.6
±
1.29。其中，当静置孵育时间达到48h时，线虫卵囊受0.3％次氯酸钠离解的效率可达到最高，且不再受静置孵育时间延长的影响(图1)。
[0031]
实施例2不同naclo处理浓度对南方根结线虫卵回收和孵化的影响
[0032]
1)材料方法：采集南方根结线虫侵染的南瓜病根，并将其在28℃条件下(保湿)放置48h；之后，用自来水彻底冲洗病根组织；体视镜下，镊子挑取大小一致10颗(乳白色)南方根结线虫卵囊；将挑取的线虫卵囊置于含有500μl无菌水的1.5ml离心管中；1600rpm转速下离心2min后，用移液器充分移除上清，分成5份；在含有卵囊的各离心管中，分别加入1ml且有效浓度为0％(无菌水)、0.3％、0.5％、1.0％、1.5％和2％的次氯酸钠(naclo)溶液，其中每个处理包含5个独立的技术重复(replicate)；将样品在涡旋震荡器上反复震荡，2min后，将样品在1600rpm条件下离心2min，弃掉上清，并用无菌水充分洗涤样品3次；加入500μl无菌水，将各样品混匀后于实验台上静置5-10秒后，取10μl上层卵粒悬浮液，在体视镜下对线虫卵粒进行计数；之后取200颗卵粒，于28℃避光条件下孵化3天，统计卵粒的孵化数(见表1)。实验包含三次生物学重复。
[0033]
2)0.3％的次氯酸钠溶液可有效离解南方根结线虫卵囊，且对卵粒伤害较小，通过比较不同有效浓度醋氯酸钠溶液对南方根结线虫卵囊的离解率，我们首先将南瓜病根在28℃条件下静置孵育48h。接下来的实验结果表明，和无菌水(0％的次氯酸钠)相比，0.3％、0.5％、1％、1.5％和2％的次氯酸钠溶液可显著提高线虫卵粒的获得率(one-way analysis ofvariance；p<0.01)。有趣的是我们发现，0.3％、1％、1.5％和2％的次氯酸钠溶液在离解线虫卵囊上，作用相当(表1)。为更好比较不同浓度次氯酸钠溶液对线虫卵粒可能造成的伤害，我们对获得卵粒的孵化情况进行了分析统计。实验结果显示(表1)，0.3％的次氯酸钠溶液不仅可有效增强静置孵育后线虫卵囊的离解，同时对线虫卵粒的伤害也较低(one-way analysis ofvariance；p<0.01)。
[0034]
表1不同浓度次氯酸钠处理南方根结线虫卵囊卵粒和二龄幼虫数量
[0035][0036]
实施例3：naclo不同处理时间对南方根结线虫卵孵化率的影响
[0037]
1)材料方法：28℃条件下(保湿)放置48h的植物病根用自来水彻底冲洗后，用镊子从中挑取10颗(乳白色)南方根结线虫卵囊；将挑取的线虫卵囊置于含有500μl无菌水的1.5ml离心管中；1600rpm转速下离心2min后，用移液器充分移除上清；在含有卵囊的各离心管中，加入1ml且有效浓度为0.3％次氯酸钠(naclo)溶液分别处理样品2、5、8和10min，期间将样品在涡旋震荡器上反复震荡，其中每个处理包含5个独立的技术重复(replicate)；将样品在1600rpm条件下离心2min，弃掉上清，并用无菌水充分洗涤样品3次；加入500μl无菌
水，将各样品混匀后于实验台上静置5-10秒后，从上层卵粒悬浮液取200颗卵粒,于28℃避光条件下孵化3天，最后统计卵粒的孵化数(见图2)。实验包含三次生物学重复。
[0038]
2)0.3％次氯酸钠的长时间处理可影响南方根结线虫卵粒的孵化，为探究次氯酸钠处理时长对南方根结线虫卵粒正常孵化造成的影响，我们用0.3％的次氯酸钠溶液对静置处理的线虫卵囊分别离解2、5、8和10min，然后通过统计3天后卵粒的孵化数发现，当次氯酸钠溶液处理时长为2和5min时，线虫卵粒的孵化数分别为63.2
±
2.89和59.8
±
2.00，而处理8和10min的孵化数则分别为44.4
±
1.63和35
±
1.84，且结果存在显著性差异(one-way analysis ofvariance；p<0.01)。于是我们认为当次氯酸钠溶液为低浓度时，离解时间的延长同样可对南方根结线虫卵粒造成伤害，并进而影响其正常孵化(图2)。
[0039]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。