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一种烟草中根结线虫的鉴定方法.pdf

花匠小妙招
2025-01-05 14:50

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610585565.X (22)申请日 2016.07.25 (71)申请人云南省烟草农业科学研究院地址 650021 云南省昆明市圆通街33号 (72)发明人曾建敏曾永三李梅云焦芳婵吴兴富方敦煌李永平 (74)专利代理机构昆明知道专利事务所(特殊普通合伙企业) 53116 代理人王远同谢乔良 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称一种烟草中根结线虫的鉴定方法 (57)摘要本发明公开了一种烟草中根结线虫的鉴定方法，。

2、所述的鉴定方法集形态和分子特征为一体，包括： 1）形态学鉴定； 2）提取DNA； 3） LSU28S rDNAD2-D3序列扩增：用根结线虫通用引物 RK28SF/MR对步骤2中已提取的DNA进行PCR扩增，检测，如果得到大小为614bp的序列，则初步鉴定为根结线虫，进行分子系统发育树的构建； 4）分子系统发育树的构建，通过系统发育关系分析确定待测线虫是否为根结线虫； 5)序列特征扩增区域SCAR-PCR检测。本发明为烟草根结线虫种类的高效、准确鉴定提供了强有力的技术体系，为掌握根结线虫在烟草种植区的分布及危害程度提供了良好基础。权利要求书2页说明。

3、书7页序列表2页附图2页 CN 106191273 A 2016.12.07 CN 106191273 A 1.一种烟草中根结线虫的鉴定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤： 1）形态学鉴定：采用五点取样法，从典型的烟草病株上采集病根标本连同500g的根际土壤装于密封袋中；从采集的病根标本及土壤中分离出线虫，采用玻片加热方法进行线虫的杀死，用TAF液固定，然后制作线虫玻片标本，来不及处理的样本，将其装入密封袋放入4 冰箱保存；在光学显微镜下进行线虫的形态特征观察并使用测微尺进行线虫各形态特征值的测量，或通过配在显微镜上的绘图仪在纸上绘出虫体后再进行测量，完成。

4、测量后，按照 De Man公式计算线虫的形态特征测量值，统计测量值，拍摄重要形态特征图片，完成形态学鉴定，初步鉴定出同种线虫； 2）提取DNA：取510条步骤1初步鉴定出的同种线虫的雌虫，挑至盛有蠕虫裂解液的 1.5mL的离心管中；将上述离心管放入6570的水浴锅恒温加热1h以上，然后95加热 15min，即可得到线虫的DNA提取液， 4下保存备用； 3） LSU 28S rDNA D2-D3序列扩增：用根结线虫通用引物RK28SF/MR对步骤2中已提取的DNA进行PCR扩增，上游引物为 RK28SF ： 5 - CGGATAGAGTCGGCGTATC-3 ，下游。

5、引物为MR ： 5 - AACCGCTTCGGACTTCCACCAG - 3 ，对线虫LSU 28S rDNA D2-D3区片段的序列进行扩增，纯化，然后对所得的PCR扩增产物电泳检测，如果得到大小为614bp 的序列，则初步鉴定为根结线虫，接着进行分子系统发育树的构建；如果得不到大小为614bp的条带，则不是根结线虫，不再进行鉴定； 4）分子系统发育树的构建：将经过步骤3扩增、纯化及检测得到的序列在NCBI中进行BLAST比对，选出匹配高的序列，然后利用MEGA软件构建线虫系统发育树，步骤包括序列比对、编辑、选择建树算法和系统发育树的测试；所述建树。

6、算法为邻位相连法NJ，所述系统发育树的测试采用自助法 Bootstrap，重复次数设为1000；对构建的分子系统发育树进行分析，如果待测线虫以99% 的支持度与来自GenBank的根结线虫种群归在一个支系，则说明待测线虫为根结线虫； 5) 序列特征扩增区域 SCAR-PCR 检测： Mi-F/Mi-R和Inc K14F/Inc K14R为南方根结线虫的特有引物，所述Mi-F序列为5 -GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3 ， Mi-R序列为5 -ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3 ；所述Inc K14F序列为5 -GGGATGTGTAAATGCTCCTG-。

7、3 ， Inc K14R序列为5 -CCCGCTACACCCTCAACTTC-3 ； Fjav/Rjav为爪哇根结线虫特有引物，所述Fjav序列为5 -GGTGCGCGATTGAACTGAGC-3 ， Rjav序列为5 -CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC-3 ； Far/Rar为花生根结线虫特有引物，所述Far序列为5 -TCGGCGATAGAGGTAAATGAC-3 ， Rar序列为5 -TCGGCGATAGACACTACAAACT-3 ；用南方根结线虫特有引物Mi-F/Mi-R和Inc K14F/Inc K14R分别对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩。

8、增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，分别得到1条大小为999bp和399bp条带的种群为南方根结线虫；用爪哇根结线虫特有引物Fjav/Rjav对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，得权利要求书 1/2 页 2 CN 106191273 A 2 到1条大小为720bp的带的种群为爪哇根结线虫；用花生根结线虫特有引物Far/Rar对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，得到1条大小为420bp 的带的种群为花生根结线虫。 2.根据权利要求1所述的烟草中根结线虫的鉴定方法。

9、，其特征在于步骤1中所述的分离出线虫的方法为直接解剖法、贝曼漏斗法、卡勃过筛分离法中的一种。 3.根据权利要求1所述的烟草中根结线虫的鉴定方法，其特征在于步骤1中所述的玻片加热方法为首先将一个凹玻片中滴加一滴清水，将待检线虫挑入清水中，并用酒精灯加热凹玻片，每隔 23 秒，在体视显微镜下观察线虫的状态，直至线虫形态固定不变时，用挑针挑取2030条各个虫态的线虫放入盛有TAF固体液的1.5mL的离心管中固定，所述TAF固体液的配方为40%甲醛7mL，三乙醇胺2mL，蒸馏水91 mL。 4.根据权利要求1所述的烟草中根结线虫的鉴定方法，其特征在于步骤1中所述制。

10、作线虫玻片标本为制作线虫临时标本或永久标本。 5.根据权利要求1所述的烟草中根结线虫的鉴定方法，其特征在于步骤3中所述的PCR 扩增的PCR体系为总体积25L，包括1.0L模板DNA， 9.5L ddH20， 12.5L2X TaqMaster Mix， 1.0L上游引物， 1.0L下游引物。 6.根据权利要求1所述的烟草中根结线虫的鉴定方法，其特征在于步骤3中所述的PCR 扩增的PCR反应条件为94预变性4min； 94变性30s； 56退火40s； 72延伸1min，共35个循环，最后一个循环结束后， 72延伸10min。 7.根据权利要求1所述的烟草中根结线虫的鉴定方法，。

11、其特征在于步骤3中所述的电泳检测为吸取4L的PCR产物点样于1%的琼脂糖凝胶， 120V下进行电泳2030min后取出，在紫外光透射仪下观察，并在凝胶成像系统中拍照。 8.根据权利要求1所述的烟草中根结线虫的鉴定方法，其特征在于步骤5中所述的PCR 扩增的PCR体系为总体积25L，包括1.0L模板DNA， 9.5L ddH20， 12.5L2X TaqMaster Mix， 1.0L上游引物， 1.0L下游引物。 9.根据权利要求1所述的烟草中根结线虫的鉴定方法，其特征在于步骤5中所述的PCR 扩增的PCR反应条件为94预变性4min； 94变性30s； 56退火40s； 72延。

12、伸1min，共35个循环，最后一个循环结束后， 72延伸10min。 10.根据权利要求1所述的烟草中根结线虫的鉴定方法，其特征在于步骤5中所述的电泳检测为吸取4L的PCR产物点样于1%的琼脂糖凝胶， 110V下进行电泳4045min后取出，在紫外光透射仪下观察，并在凝胶成像系统中拍照。权利要求书 2/2 页 3 CN 106191273 A 3 一种烟草中根结线虫的鉴定方法技术领域 0001 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种烟草中根结线虫的鉴定方法。背景技术 0002 一直以来，根结线虫种的鉴定是依据线虫的形态学特征和形态测量值，尤其是根结线虫雌虫的会阴花纹。

13、形态特征。但在传统的形态学特征中，由于根结线虫种类较多，其形态特征在种内存在变异性，如雌虫的会阴花纹等通常存在着种内变异；另外，同种内有些形态测量值也存在覆盖现象。因此，形态鉴定需要相当的经验和技巧，而且结果往往不可靠。 0003 因此，结合其他鉴定手段对获得更准确的鉴定结果是很有必要的。这些手段包括，线虫DNA分子特征，同工酶类型等。目前，利用根结线虫的分子特征鉴定根结线虫的种已有较多成功的例子。近年来，学者们通过利用根结线虫的特有引物进行SCAR PCR扩增获得特有片段序列成功鉴定了一些根结线虫包括常见的几个种类。但是其中的问题是，很多研究中。

14、用根结线虫的特殊引物PCR扩增前，没有采用根结线虫通用引物进行初步的鉴定和进一步的确认，结果往往是其PCR扩增产物经电泳检测后，未发现亮带，由此再进行大量不同的特有引物扩增实验，进行大量的筛选，最后却发现所检测的线虫不是根结线虫，浪费了大量的时间和精力。发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种烟草中根结线虫的鉴定方法。 0005 本发明的目的是这样实现的，包括以下步骤： 1）形态学鉴定：采用五点取样法，从典型的烟草病株上采集病根标本连同500g的根际土壤装于密封袋中；从采集的病根标本及土壤中分离出线虫，采用玻片加热方法进行线虫的杀死，用TAF液固定，。

15、然后制作线虫玻片标本，来不及处理的样本，将其装入密封袋放入4 冰箱保存；在光学显微镜下进行线虫的形态特征观察并使用测微尺进行线虫各形态特征值的测量，或通过配在显微镜上的绘图仪在纸上绘出虫体后再进行测量，完成测量后，按照 De Man公式计算线虫的形态特征测量值，统计测量值，拍摄重要形态特征图片，完成形态学鉴定，初步鉴定出同种线虫； 2）提取DNA：取510条步骤1初步鉴定出的同种线虫的雌虫，挑至盛有蠕虫裂解液的 1.5mL的离心管中；将上述离心管放入6570的水浴锅恒温加热1h以上，然后95加热 15min，即可得到线虫的DNA提取液， 4下保存备用； 3。

16、） LSU 28S rDNA D2-D3序列扩增：用根结线虫通用引物RK28SF/MR对步骤2中已提取的DNA进行PCR扩增，上游引物为 RK28SF ： 5 - CGGATAGAGTCGGCGTATC-3 ，下游引物为MR ： 5 - AACCGCTTCGGACTTCCACCAG - 3 ，对线虫LSU 28S rDNA D2-D3区片段的序列进行扩增，纯化，然后对所得的PCR扩增产物电泳检测，如果得到大小为614bp 的序列，则初步鉴定为根结线虫，接着进行分子系统发育树的构建；如果得不到大小为614bp的条带，则不是根结线虫，不再进行鉴定；说明书 1/7 页。

17、4 CN 106191273 A 4 4）分子系统发育树的构建：将经过步骤3扩增、纯化及检测得到的序列在NCBI中进行BLAST比对，选出匹配高的序列，然后利用MEGA软件构建线虫系统发育树，步骤包括序列比对、编辑、选择建树算法和系统发育树的测试；所述建树算法为邻位相连法NJ，所述系统发育树的测试采用自助法 Bootstrap，重复次数设为1000；对构建的分子系统发育树进行分析，如果待测线虫以99% 的支持度与来自GenBank的根结线虫种群归在一个支系，则说明待测线虫为根结线虫； 5) 序列特征扩增区域 SCAR-PCR 检测： Mi-F/Mi-R和Inc 。

18、K14F/Inc K14R为南方根结线虫的特有引物，所述Mi-F序列为5 -GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3 ， Mi-R序列为5 -ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3 ；所述Inc K14F序列为5 -GGGATGTGTAAATGCTCCTG-3 ， Inc K14R序列为5 -CCCGCTACACCCTCAACTTC-3 ； Fjav/Rjav为爪哇根结线虫特有引物，所述Fjav序列为5 -GGTGCGCGATTGAACTGAGC-3 ， Rjav序列为5 -CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC-3 ； Far/Rar为花生根结线虫特有引物，所。

19、述Far序列为5 -TCGGCGATAGAGGTAAATGAC-3 ， Rar序列为5 -TCGGCGATAGACACTACAAACT-3 ；用南方根结线虫特有引物Mi-F/Mi-R和Inc K14F/Inc K14R分别对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，分别得到1条大小为999bp和399bp条带的种群为南方根结线虫；用爪哇根结线虫特有引物Fjav/Rjav对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，得到1条大小为720bp的带的种群为爪哇根结线虫；用花生根结线虫特有引。

20、物Far/Rar对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，得到1条大小为420bp 的带的种群为花生根结线虫。 0006 本发明的有益效果： 1、本发明在进行特有引物的PCR扩增之前，进行根结线虫通用引物的扩增和检测，并通过分子系统发育树的构建来确定待测线虫为根结线虫，避免了因为待测线虫不是根结线虫而引起的进行大量不同的特有引物扩增实验却无法得到结果的情况，大大节省了时间和精力，不仅提高了鉴定结果的准确性，而且还可以提高鉴定效率。 0007 2、本发明为烟草根结线虫种类的高效、准确鉴定提供了强有力的技术体系，为掌。

21、握根结线虫在烟草种植区的分布及危害程度，以及为烟草的抗线虫病育种提供了良好基础。附图说明 0008 图1为实施例1中采用花生根结线虫特有引物对13个花生根结线虫种群的PCR扩增产物的电泳图；图2为实施例1中采用爪哇根结线虫特有引物对6个爪哇根结线虫种群的PCR扩增产物的电泳图；说明书 2/7 页 5 CN 106191273 A 5 图3为实施例1中采用南方根结线虫特有引物对2个南方根结线虫种群的PCR扩增产物的电泳图。具体实施方式 0009 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明。

22、的保护范围。 0010 本发明的烟草中根结线虫的鉴定方法，包括以下步骤： 1）形态学鉴定：采用五点取样法，从典型的烟草病株上采集病根标本连同500g的根际土壤装于密封袋中；从采集的病根标本及土壤中分离出线虫，采用玻片加热方法进行线虫的杀死，用TAF液固定，然后制作线虫玻片标本，来不及处理的样本，将其装入密封袋放入4 冰箱保存；在光学显微镜下进行线虫的形态特征观察并使用测微尺进行线虫各形态特征值的测量，或通过配在显微镜上的绘图仪在纸上绘出虫体后再进行测量，完成测量后，按照 De Man公式计算线虫的形态特征测量值，统计测量值，拍摄重要形态特征图片，完成形态。

23、学鉴定，初步鉴定出同种线虫； 2）提取DNA：取510条步骤1初步鉴定出的同种线虫的雌虫，挑至盛有蠕虫裂解液的 1.5mL的离心管中；将上述离心管放入6570的水浴锅恒温加热1h以上，然后95加热 15min，即可得到线虫的DNA提取液， 4下保存备用； 3） LSU 28S rDNA D2-D3序列扩增：用根结线虫通用引物RK28SF/MR对步骤2中已提取的DNA进行PCR扩增，上游引物为 RK28SF ： 5 - CGGATAGAGTCGGCGTATC-3 ，下游引物为MR ： 5 - AACCGCTTCGGACTTCCACCAG - 3 ，对线虫LSU 28S r。

24、DNA D2-D3区片段的序列进行扩增，纯化，然后对所得的PCR扩增产物电泳检测，如果得到大小为614bp 的序列，则初步鉴定为根结线虫，接着进行分子系统发育树的构建；如果得不到大小为614bp的条带，则不是根结线虫，不再进行鉴定； 4）分子系统发育树的构建：将经过步骤3扩增、纯化及检测得到的序列在NCBI中进行BLAST比对，选出匹配高的序列，然后利用MEGA软件构建线虫系统发育树，步骤包括序列比对、编辑、选择建树算法和系统发育树的测试；所述建树算法为邻位相连法NJ，所述系统发育树的测试采用自助法 Bootstrap，重复次数设为1000；对构。

25、建的分子系统发育树进行分析，如果待测线虫以99% 的支持度与来自GenBank的根结线虫种群归在一个支系，则说明待测线虫为根结线虫； 5) 序列特征扩增区域 SCAR-PCR 检测： Mi-F/Mi-R和Inc K14F/Inc K14R为南方根结线虫的特有引物，所述Mi-F序列为5 -GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3 ， Mi-R序列为5 -ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3 ；所述Inc K14F序列为5 -GGGATGTGTAAATGCTCCTG-3 ， Inc K14R序列为5 -CCCGCTACACCCTCAACTTC-3 ； Fjav/Rjav为。

26、爪哇根结线虫特有引物，所述Fjav序列为5 -GGTGCGCGATTGAACTGAGC-3 ， Rjav序列为5 -CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC-3 ； Far/Rar为花生根结线虫特有引物，说明书 3/7 页 6 CN 106191273 A 6 所述Far序列为5 -TCGGCGATAGAGGTAAATGAC-3 ， Rar序列为5 -TCGGCGATAGACACTACAAACT-3 ；用南方根结线虫特有引物Mi-F/Mi-R和Inc K14F/Inc K14R分别对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，分别得。

27、到1条大小为999bp和399bp条带的种群为南方根结线虫；用爪哇根结线虫特有引物Fjav/Rjav对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，得到1条大小为720bp的带的种群为爪哇根结线虫；用花生根结线虫特有引物Far/Rar对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，得到1条大小为420bp 的带的种群为花生根结线虫。 0011 步骤1中所述的分离出线虫的方法为直接解剖法、贝曼漏斗法、卡勃过筛分离法中的一种。 0012 步骤1中所述的玻片加热方法为首先将一个凹玻片中滴加。

28、一滴清水，将待检线虫挑入清水中，并用酒精灯加热凹玻片，每隔 23 秒，在体视显微镜下观察线虫的状态，直至线虫形态固定不变时，用挑针挑取2030条各个虫态的线虫放入盛有TAF固体液的1.5mL 的离心管中固定，所述TAF固体液的配方为40%甲醛7mL，三乙醇胺2mL，蒸馏水91 mL。 0013 步骤1中所述制作线虫玻片标本为制作线虫临时标本或永久标本。 0014 步骤3中所述的PCR扩增的PCR体系为总体积25L，包括1.0L模板DNA， 9.5L ddH20， 12.5L2X TaqMaster Mix， 1.0L上游引物， 1.0L下游引物。 0015 步骤3中所述。

29、的PCR扩增的PCR反应条件为94预变性4min； 94变性30s； 56退火40s； 72延伸1min，共35个循环，最后一个循环结束后， 72延伸10min。 0016 步骤3中所述的电泳检测为吸取4L的PCR产物点样于1%的琼脂糖凝胶， 120V下进行电泳2030min后取出，在紫外光透射仪下观察，并在凝胶成像系统中拍照。 0017 步骤5中所述的PCR扩增的PCR体系为总体积25L，包括1.0L模板DNA， 9.5L ddH20， 12.5L2X TaqMaster Mix， 1.0L上游引物， 1.0L下游引物。 0018 步骤5中所述的PCR扩增的PCR反应条件为94。

30、预变性4min； 94变性30s； 56退火40s； 72延伸1min，共35个循环，最后一个循环结束后， 72延伸10min。 0019 步骤5中所述的电泳检测为吸取4L的PCR产物点样于1%的琼脂糖凝胶， 110V下进行电泳4045min后取出，在紫外光透射仪下观察，并在凝胶成像系统中拍照。 0020 实施例1 从云南省的烟草种植区采集根结线虫样本，采集地点见表1。 0021 表1. 烟草根结线虫种群及其采集地点序号种群编号地点坐标 1LC-YD-1临沧市永德县永康海新村99.266055,24.023452 2LC-YD-2临沧市永德县德党镇大坝村99.286349,23。

31、.976857 3LC-CY-1临沧市沧源县岩帅镇东米村99.566799,23.295057 4LC-FQ-1临沧凤庆县洛党镇田心村100.030098,24.533861 5LC-SJ-1临沧市双江县邦丙乡99.855325,23.261205 6LC-SJ-2临沧市双江县丫口99.672758,23.501379 7LC-GM-1临沧耿马县大兴乡岩榴村99.811342,23.797391 说明书 4/7 页 7 CN 106191273 A 7 8LC-GM-2临沧耿马县大兴村99.813336,23.801312 9LC-ZK-2临沧市镇康县营盘乡营盘村102.541627,24.3。

32、62121 10LC-ZK-1临沧市镇康县岔沟村99.566799,23.295057 11YX-CJ-1玉溪市澄江县九村乡龙潭村102.996589,24.686844 12YX-CJ-2玉溪市澄江县海口乡罗家村102.917331,24.677799 13YX-HT-1玉溪市红塔区北城乡大湾村102.573944,24.456685 14YX-HT-2玉溪市红塔区高仓乡龙树村102.524578,24.318802 15YX-HT-3玉溪市红塔区龙泉乡菜园村102.524776,24.319325 16YX-YM-1玉溪易门县浦贝乡水塘村102.190833,24.616749 17ZT-。

33、SY-1昭通市昭阳区守望乡103.75524,27.266037 18ZT-SY-2昭通市昭阳区布嘎乡103.722035,27.213835 19WS-YS-1文山州砚山县平远大新村103.756612,23.754958 20WS-YS-2文山州砚山县平远洪福村103.352464,23.669483 21QJ-ZY-1曲靖市沾益县大坡乡大坡村103.67085,25.685974 1）形态学鉴定：采用五点取样法，从典型的烟草病株上采集病根标本连同500g的根际土壤装于密封袋中；用直接解剖法从采集的病根标本及土壤中分离出线虫，采用玻片加热方法进行线虫的杀死，用TAF液固定，。

34、然后制作线虫玻片标本，来不及处理的样本，将其装入密封袋放入4 冰箱保存；在光学显微镜下进行线虫的形态特征观察并使用测微尺进行线虫各形态特征值的测量，或通过配在显微镜上的绘图仪在纸上绘出虫体后再进行测量，完成测量后，按照De Man公式计算线虫的形态特征测量值，统计测量值，拍摄重要形态特征图片，完成形态学鉴定，初步鉴定出同种线虫；所述的玻片加热方法为首先将一个凹玻片中滴加一滴清水，将待检线虫挑入清水中，并用酒精灯加热凹玻片，每隔 23 秒，在体视显微镜下观察线虫的状态，直至线虫形态固定不变时，用挑针挑取2030条各个虫态的线虫放入盛有TAF固体液。

35、的1.5mL的离心管中固定，所述TAF固体液的配方为40%甲醛7mL，三乙醇胺 2mL，蒸馏水91 mL。所述制作线虫的玻片标本为制作线虫临时标本。 0022 形态学鉴定结果如下：表2. 云南烟草根结线虫(M elo i d og yne spp.)种类编号花生根结线虫南方根结线虫爪哇根结根结线虫 LC-YD-1 LC-YD-2 LC-CY-1 LC-FQ-1 LC-SJ-1 LC-SJ-2 LC-GM-1 LC-GM-2 LC-ZK-1 LC-ZK-2 YX-CJ-1 说明书 5/7 页 8 CN 106191273 A 8 YX-CJ-2 YX-HT-1 YX-HT-2 YX-。

36、HT-3 YX-YM-1 ZT-SY-1 ZT-SY-2 WS-YS-1 WS-YS-2 QJ-ZY-1 2）提取DNA：取510条步骤1初步鉴定出的同种线虫的雌虫，挑至盛有蠕虫裂解液的 1.5mL的离心管中；将上述离心管放入6570的水浴锅恒温加热1h以上，然后95加热 15min，即可得到线虫的DNA提取液， 4下保存备用； 3） LSU 28S rDNA D2-D3序列扩增：用根结线虫通用引物RK28SF/MR对步骤2中已提取的DNA共21个种群进行PCR扩增，上游引物为 RK28SF ： 5 - CGGATAGAGTCGGCGTATC-3 ，下游引物为MR ： 5。

37、 - AACCGCTTCGGACTTCCACCAG -3 ，对线虫LSU 28S rDNA D2-D3区片段的序列进行扩增，纯化，然后对所得的PCR扩增产物电泳检测，均得到大小为614bp 的序列；步骤3中所述的PCR扩增的PCR体系为总体积25L，包括1.0L模板DNA， 9.5L ddH20， 12.5L2X TaqMaster Mix， 1.0 L上游引物， 1.0L下游引物；所述的PCR扩增的PCR反应条件为94预变性4min； 94变性 30s； 56退火40s； 72延伸1min，共35个循环，最后一个循环结束后， 72延伸10min；所述的电泳检测为吸取4。

38、L的PCR产物点样于1%的琼脂糖凝胶， 120V下进行电泳2030min后取出，在紫外光透射仪下观察，并在凝胶成像系统中拍照； 4）分子系统发育树的构建：将经过步骤3扩增、纯化及检测得到的序列在NCBI中进行BLAST比对，选出匹配高的序列，然后利用MEGA软件构建线虫系统发育树，步骤包括序列比对、编辑、选择建树算法和系统发育树的测试；所述建树算法为邻位相连法NJ，所述系统发育树的测试采用自助法 Bootstrap，重复次数设为1000；对构建的分子系统发育树进行分析；用这个序列进行BLAST搜寻，获得与本研究所得序列匹配度高的21个序列；基于根结线虫。

39、（M e l o i d o g y n espp.）的rDNA LSU 28S D2-D3序列的系统发育树分析表明：（1）本研究的21个形态学鉴定为根结线虫的种群与来自GenBank的21个根结线虫种群归在一个支系，支持度为99%；与根结线虫同一总科的短体线虫、胞囊线虫及螺旋线虫则聚于另一个不同支系中；（2）本研究21个形态学鉴定为根结线虫的种群与来自GenBank的2个花生根结线虫种群（KP901082和EU364889）、 5个爪哇根结线虫种群（JQ317914， KP901083， KP901084， JX100423和JQ317913）、 2个南方根结线虫。

40、种群（KP901070和KP901072）、M .l o p e z i （KF993617）、M .pa ra na ens is（KF 993620）和M .iza lcoens is（KF993621）以低的支持度（54%）聚于一个系。 0023 因此，可以确定本研究的21个种群均为根结线虫。 0024 5) 序列特征扩增区域 SCAR-PCR 检测：说明书 6/7 页 9 CN 106191273 A 9 Mi-F/Mi-R和Inc K14F/Inc K14R为南方根结线虫的特有引物，所述Mi-F序列为5 -GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3 ， Mi-R。

41、序列为5 -ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3 ；所述Inc K14F序列为5 -GGGATGTGTAAATGCTCCTG-3 ， Inc K14R序列为5 -CCCGCTACACCCTCAACTTC-3 ； Fjav/Rjav为爪哇根结线虫特有引物，所述Fjav序列为5 -GGTGCGCGATTGAACTGAGC-3 ， Rjav序列为5 -CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC-3 ； Far/Rar为花生根结线虫特有引物，所述Far序列为5 -TCGGCGATAGAGGTAAATGAC-3 ， Rar序列为5 -TCGGCGATAGACACTACAAACT-。

42、3 ；用花生根结线虫特有引物（Far/Rar）对21个种群进行PCR扩增，对所得的PCR扩增产物电泳检测，仅有13个种群LC-YD-1、 LC-ZK-1、 LC-ZK-2、 LC-FQ-1、 LC-SJ-1、 LC-SJ-2、 YX-CJ-1、 YX-CJ-2、 YX-HT-1、 YX-HT-2、 YX-HT-3、 WS-YS-1、 WS-YS-2和阳性对照种群（ABMa，引起巴榕根结线虫病的花生根结线虫， Huang et al.， 2013）得到1条大小为420bp 的带；采用花生根结线虫特有引物对13个花生根结线虫种群的PCR扩增产物的电泳图见图1，其中M： 1。

43、KB DNA Marker， N： negative control ；而用爪哇根结线虫特有引物（Fjav/Rjav）及南方根结线虫特有引物（MI-R/MI-F和Inc K14F/Inc K14R）扩增则没有产生任何条带；阴性对照（水）没有产生条带。因此，这13个种群属于花生根结线虫(M e l o i d o g y n e a r e n a r i a)。 0025 用爪哇根结线虫特有引物（Fjav/Rjav）对21个种群进行PCR扩增，对所得的PCR扩增产物电泳检测，仅有6个种群LC-YD-2、 LC-CY-1、 LC-GM-1、 LC-GM-2、 Y。

44、X-YM-1、 QJ-ZY-1和阳性对照种群（VW4）得到1条大小为720bp 的带；采用爪哇根结线虫特有引物对6个爪哇根结线虫种群的PCR扩增产物的电泳图见图2，其中M： 1KB DNA Marker， N： negative control ；而用花生根结线虫特有引物（Far/Rar）及南方根结线虫特有引物（MI-R/MI-F和Inc K14F/ Inc K14R）扩增则没有产生任何条带；阴性对照（水）未产生条带；因此，这6个种群属于爪哇根结线虫(M e l o i d o g y n e ja v a n i c a)。 0026 用南方根结线虫特有引物。

45、（MI-F/MI-R）对21个种群进行PCR扩增，对所得的PCR扩增产物电泳检测，仅有2个种群ZT-SY-1、 ZT-SY-2和阳性对照种群（RSMi，引起幌伞枫根结线虫病的南方根结线虫， Zeng et al.， 2014）得到1条大小为999bp 的带；采用南方根结线虫特有引物对2个南方根结线虫种群的PCR扩增产物的电泳图见图3，其中M： 1KB DNA Marker， N： negative control；而用花生根结线虫特有引物（Far/Rar）及爪哇根结线虫特有引物（Fjav/Rjav）扩增则没有产生任何条带；阴性对照（水）未产生条带。因此。

46、，这2个种群属于南方根结线虫(M e l o i d o g y n e i n c o g n i ta)。步骤5中所述的PCR扩增的PCR体系为总体积25L，包括1.0L模板DNA， 9.5L ddH20， 12.5L2X TaqMaster Mix， 1.0L上游引物， 1.0L下游引物；所述的PCR扩增的PCR反应条件为94预变性4min； 94变性30s； 56退火 40s； 72延伸1min，共35个循环，最后一个循环结束后， 72延伸10min；所述的电泳检测为吸取4L的PCR产物点样于1%的琼脂糖凝胶， 110V下进行电泳4045min后取出，在紫外光透。

47、射仪下观察，并在凝胶成像系统中拍照。说明书 7/7 页 10 CN 106191273 A 10 SEQUENCE LISTING 云南省烟草农业科学研究院一种烟草中根结线虫的鉴定方法 2016 10 PatentIn version 3.5 1 19 DNA RK28SF 1 cggatagagt cggcgtatc 19 2 22 DNA MR 2 aaccgcttcg gacttccacc ag 22 3 21 DNA Far 3 tcggcgatag aggtaaatga c 21 4 22 DNA Rar 4 tcggcgatag acactacaaa ct 22 5 20 D。

48、NA Fjav 5 ggtgcgcgat tgaactgagc 20 6 23 序列表 1/2 页 11 CN 106191273 A 11 DNA Rjav 6 caggcccttc agtggaacta tac 23 7 20 DNA Inc-k14-F 7 gggatgtgta aatgctcctg 20 8 20 DNA Inc-k14-R 8 cccgctacac cctcaacttc 20 9 20 DNA Mi-F 9 gtgaggattc agctccccag 20 10 23 DNA Mi-R 10 acgaggaaca tacttctccg tcc 23 序列表 2/2 页 12 CN 106191273 A 12 图1 图2 说明书附图 1/2 页 13 CN 106191273 A 13 图3 说明书附图 2/2 页 14 CN 106191273 A 14 。