首页 > 分享 > 藏药绿萝花在制备治疗动脉粥样硬化药物中的用途的制作方法

藏药绿萝花在制备治疗动脉粥样硬化药物中的用途的制作方法

花匠小妙招
2025-01-05 17:03

本发明涉及中药技术领域，具体为藏药绿萝花在制备治疗动脉粥样硬化药物中的用途。

背景技术：

随着现代科技的发展和工作生活节奏的加快，慢性病(如心血管疾病、糖尿病等)已成为人类健康关注的新焦点，其中，心血管疾病是危害人类健康的头号杀手，其死亡率高于肿瘤、糖尿病等疾病。据who统计，至2030年心血管疾病将影响全球2360万人。据《2018年中国心血管疾病报告》显示，我国每5例死亡人中，就有2例死于心血管疾病，且其发病率逐步攀升，且有低龄化的发展趋势。

动脉粥样硬化(as)是诱发心血管疾病的主要病理基础，也是心血管疾病患者死亡的主要原因。它是指在多种危险因素作用下，血管内皮细胞结构或功能受损，细胞膜通透性发生改变，血脂异常沉积到内膜下为主要特征的渐进性病理过程，伴随有炎症细胞浸润，中膜平滑肌细胞迁移、增殖，泡沫细胞形成和细胞外基质合成增加，最终形成动脉粥样硬化斑块。

目前，治疗动脉粥样硬化的主要方法是降低血清中高胆固醇水平，临床上主要依靠他汀类药物防治as，然而该方法仅能使心血管疾病死亡率降低30％，仍有大量患者对他汀类药物不敏感，动脉粥样硬化依然会进一步恶化，最终死于心肌梗死或中风等心血管疾病。因此，寻找有效抑制动脉粥样硬化发生发展的新作用靶点和方法，对于降低心血管疾病的发病率和死亡率具有重要的科学意义。

藏药绿萝花，是瑞香科植物结香属滇结香的干燥花蕾，主要分布于中国青藏及滇部海拔三千米以上的较寒地区，是西藏地区特有的民族特色习用药材，被称为“青藏十八宝”之一。据《藏医养身图说》记载，绿萝花对冠心病等心血管疾病具有良好的辅助疗效。民间亦常将绿萝花泡水饮用，预防冠心病、高血压及各种血管炎等疾病。近年来国内外学者对绿萝花研究热度逐渐增加，但多停留在绿萝花粗提物及萃取物分析上，其主要含有黄酮苷类物质、香豆素、总多酚、多糖和挥发油等多种化合物，药效和药理研究主要集中于降糖、降脂、增强免疫和抗氧化等方面，缺乏绿萝花对冠心病等心血管疾病全面深入的研究。动脉粥样硬化是冠心病等心血管疾病的主要诱发因素和病理基础，截止目前，尚未有绿萝花抑制动脉粥样硬化的研究报道。

综上所述，因此我们研究藏药绿萝花在制备治疗动脉粥样硬化药物中的用途是很有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有的治疗动脉粥样硬化的药物毒副作用大、患者不能耐受、影响临床治疗效果的缺陷，提供绿萝花在制药中的新用途，具体涉及绿萝花在制备治疗动脉粥样硬化药物中的用途。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明采用高脂高胆固醇喂养apoe-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型，结果表明：绿萝花能减少动脉粥样硬化斑块面积，具有较好的防治小鼠动脉粥样硬化的作用；绿萝花总提物能通过抑制胆固醇吸收、减少巨噬细胞泡沫化、促进胆固醇代谢而发挥降低动脉粥样硬化斑块的作用。

本发明的有益效果：

1、本发明通过体内外实验证明了本发明所涉及的绿萝花醇提物能显著减少高脂高胆固醇喂养的apoe-/-小鼠斑块面积，增加斑块内胶原含量，进而有可能促进斑块稳定性，研究结果明确了绿萝花干预动脉粥样硬化的方向，本发明关于绿萝花在制备抗动脉粥样硬化药物用途中的应用为首次公开；

2、本发明为动脉粥样硬化的临床治疗提供一种经济有效、无毒副作用和不良反应、安全可靠的药物；

3、原料药材为常见中药材，来源广泛，原料成本低。

附图说明

为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为绿萝花醇提物对全长主动脉的动脉粥样硬化病变分析；其中，图1a为主动脉油红o染色；图1b为斑块面积占全长主动脉总面积的比值(左)，全长主动脉斑块面积(右)。

图2为绿萝花醇提物对主动脉根部斑块面积的影响；其中，图2a为主动脉根部冰冻切片苏木精-伊红染色(he)(左)，油红o染色(oilredo)(中)，masson三色染色(右)；图2b为主动脉根部冰冻切片苏木精-伊红染色(he)(左)，油红o染色(oilredo)(中)，masson三色染色(右)的统计结果图。

图3为绿萝花醇提物对胆固醇转运和代谢的相关基因表达水平的影响；图3a为肝脏中参与胆固醇代谢平衡的相关基因表达水平；图3b为小肠中参与胆固醇转运的相关基因表达水平。

图4为绿萝花醇提物对骨髓来源巨噬细胞(bmdm)的细胞活力检测。

图5为绿萝花醇提物对由ox-ldl诱导的bmdm泡沫化的影响；其中，图5a为泡沫细胞油红o染色；图5b为油红o染色结果统计图。

图6为绿萝花醇提物对由脂蛋白诱导的巨噬细胞泡沫化的影响。

图7为绿萝花醇提物对胆固醇吸收的影响；其中，图7a为各个组的荧光细胞峰图；图b为阳性细胞比例(上)和平均荧光强度值(下)。

图8为绿萝花醇提物对胆固醇结合的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.绿萝花醇提取物的制备

称取500g绿萝花干燥花蕾，等分放入两个5000ml的烧瓶中；每个烧瓶加入4000ml60％乙醇。采用控温电热套加热烧瓶，药液沸腾后2小时收集提取液8000ml；再次在每个烧瓶中加入4000ml60％乙醇继续煎煮2个小时；两次总共收集16000ml乙醇提取液，旋干浓缩后收集，放水浴锅80℃蒸干；称重，放4℃冰箱保存。人常用剂量(g/d)/正常人体重(60kg)×9.1＝小鼠剂量(g/d.bw)，中药材一般9g为最大安全剂量，换算得出2g(生药)/kg(体重)为小鼠灌胃中剂量组，以2倍数稀释药物来设置低中高(1g/kg、2g/kg、4g/kg)三个浓度的灌胃剂量组，用灭菌纯水来溶解药膏并存于4℃冰箱。

实施例2.绿萝花醇提物对全长主动脉的动脉粥样硬化病变分析

雄性apoe-/-小鼠(由南京大学-南京生物医药研究院提供)自9周龄起，随机分为4组，分别为高脂高胆固醇饲料组(highfatdiet，hfd)、高脂高胆固醇+绿萝花低剂量组(hfd+1g/kgeg)、高脂高胆固醇+绿萝花中剂量组(hfd+2g/kgeg)、高脂高胆固醇+绿萝花高剂量组(hfd+4g/kgeg)，每组给予小鼠脂肪供能占总能比例为42％的hfd。绿萝花给药组每天灌胃不同浓度的绿萝花乙醇提取物，灌胃剂量为10ml药液/kg小鼠体重，持续灌胃16周。

16周后，禁食12小时，麻醉小鼠，打开小鼠腹腔和胸腔，剪开膈肌，20ml注射器取20ml预冷磷酸盐缓冲液(pbs)推入心尖部的左心室，小鼠肌肉和内脏颜色由红色变为白色，流出的液体变为清亮，停止灌注pbs；在心尖部同一个位置匀速推注20ml预冷的4％多聚甲醛溶液(4％pfa)。灌流结束后，简单分离肺脏、胃脏和小肠，暴露心脏位置；用显微镊在体式显微镜下仔细并迅速分离全长主动脉后，用显微剪剪断两侧髂动脉；小鼠血管置于4％pfa中固定至少24小时之后进行油红o染色；用pbs漂洗15min去除固定液；60％异丙醇溶液平衡血管两次，每次5min；过滤后的0.3％油红o染色液避光室温染色15min；60％异丙醇溶液分化数秒并停止染色，血管由红色变为粉红色；纯水洗净多余染料；体式显微镜下继续去除多余脂肪组织后用显微剪剪开血管，平展血管于透明胶上，再粘在载玻片上，拍照。

结果如图1所示，与hfd模型组相比，绿萝花低、中、高剂量组小鼠主动脉斑块均明显较少，统计结果呈现显著性差异(图1a和1b)，但低、中、高剂量组间无明显差异。

实施例3.绿萝花醇提物对主动脉根部斑块面积的影响

将小鼠心脏从顶部往心尖的中间位置横切，取上半部分固定于4％pfa24小时；流水冲洗4小时；30％蔗糖溶液4℃冰箱过夜脱水；冰冻切片包埋剂(oct)包埋组织；液氮速冻后进行冰冻切片；小鼠心脏顶部朝外，切片厚度为10μm，待切片中间位置的圆形血管变为不规则椭圆形，并有两个突出的瓣膜时，开始用粘附载玻片连续收集切片，直至主动脉根部无瓣膜出现。

对切片进行苏木素伊红染色，其步骤如下：pbs溶液洗去oct包埋剂；纯水浸润5min；harris苏木素染液染细胞核3min；流水洗去多余染液，；1％盐酸酒精分化并终止染色；60℃温水反蓝；伊红染液染胞浆1min，流水洗去多余染液；脱水透明后中性树胶封片；显微镜下观察拍照，使用图像分析软件分析。

对切片进行油红o染色，其步骤如下：pbs溶液洗去oct包埋剂；纯水浸润5min；60％异丙醇溶液1min；油红o染液室温避光使用15min；60％异丙醇溶液洗去载玻片上多余油红o染液；纯水洗去异丙醇；harris苏木素染液染细胞核1min；流水洗去多余染液；1％盐酸酒精分化并终止染色；甘油明胶加热之后用来封片；显微镜下观察拍照，使用图像分析软件分析。

对切片进行胶原纤维染色，其步骤如下：pbs溶液洗去oct包埋剂；bouin氏液37℃染1h；流水冲洗切片；harris苏木素染色2min；水洗多余染液；1％盐酸酒精分化；丽春红酸性品红复红液染1min；1％冰醋酸水溶液1min；1％蹸钼酸水溶液5min；苯胺蓝溶液染色2min；1％冰醋酸水溶液浸洗1min；脱水透明后中性树胶封片；显微镜下观察拍照，使用图像分析软件分析。

结果如图2所示，绿萝花给药组的脂质面积比hfd模型组显著减少。

实施例4.绿萝花醇提物参与胆固醇转运和代谢相关基因表达水平的影响

将冷冻的肝脏或小肠研成粉末，取50mg粉末加入到1mltrizol试剂中混匀；提取总rna，反转录合成cdna；以此cdna链为模板，对肝脏中的基因如abcg5/8、sr-b1、cyp7a1和及小肠中的基因如abcg5/8和npc1l1进行realtimepcr分析。

结果如图3所示，与hfd组比较，绿萝花并未改变abcg5/8基因表达水平；中、高剂量绿萝花显著抑制了sr-b1基因表达水平；低剂量绿萝花显著增加了cyp7a1基因表达水平，这些结果表明绿萝花不会促进胆固醇流出，但会抑制胆固醇吸收并增加胆固醇代谢生成胆汁酸；与hfd组比较，绿萝花也并未改变肠细胞abcg5/8基因表达水平，但中、高剂量绿萝花显著抑制了npc1l1的表达，说明绿萝花抑制了肠道能胆固醇的吸收。

实施例5.绿萝花总提物对bmdm的细胞活力检测

绿萝花总提物用1640(b)培养基溶解，浓度为1mg/ml，过滤除菌；96孔板每孔铺4×10^4个bmdm细胞，骨髓生长培养基培养5天；配置不同浓度的含药培养基，分别为0μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml，200μg/ml；弃培养基，pbs洗两遍，加入含药培养基；培养24h；用1640(b)培养基配置mtt溶液，终浓度为1mg/ml；24h之后，结束细胞给药，弃培养基，1×pbs洗两遍，每孔加入200μlmtt溶液，孵育4小时；去除mtt溶液，每孔加入100μl的dmso，37℃孵育10min；测量吸光值(od490nm)。

结果如图4所示，绿萝花给药浓度0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、200μg/ml对bmdm细胞无细胞毒性。

实施例6.绿萝花对由ox-ldl诱导的bmdm泡沫化的影响

取小鼠骨髓来源单核细胞，经诱导成巨噬细胞后，以氧化的低密度脂蛋白诱导其变成泡沫细胞，观察绿萝花对巨噬细胞泡沫化的影响。具体实施如下：24孔板提前铺好细胞爬片，每孔铺10×10^4个bmdm细胞，培养5天；设置组别：空白组(vehicle)，脂蛋白组(ox-ldl)，不同浓度脂蛋白+绿萝花组(ox-ldl+100ngeg，ox-ldl+1μgeg，ox-ldl+10μgeg，ox-ldl+100μgeg)，脂蛋白的终浓度为80mg/ml；24h后进行泡沫细胞油红o染色，方法同实施例2.

结果如图5所示，24h后，与ox-ldl组相比，1μg/mleg能显著降低巨噬细胞泡沫化。

实施例7.绿萝花对胆固醇吸收的影响

12孔板铺4×10^5个bmdm细胞，设置组别：空白组(vehicle)，脂蛋白组(dil-oxldl)，脂蛋白+绿萝花组(dil-oxldl+eg)，脂蛋白标记了dil荧光，终浓度为10μg/ml，绿萝花浓度为1μg/ml；设置3个时间点:2h、4h和6h；培养结束后，弃培养基，酸性pbs洗4次，每次5min；胰酶消化5min，弃消化液，加入培养基把细胞吹下来；离心，1000rpm，3min；弃上清，pbs重悬细胞；转移到流式上样管中，流式细胞仪开机之后，以空白组为基准，调节电流和电压，圈住的细胞设为阴性细胞群，无荧光表达，以此为门，门外细胞群为阳性细胞群，带有荧光标记，上样结束之后统计阳性细胞数和平均荧光强度。

结果如图6所示，绿萝花给药后能减少脂质的吸收，降低巨噬细胞泡沫化。

实施例8.绿萝花对胆固醇结合的影响

12孔板铺4×10^5个bmdm，设置组别：空白组(vehicle)，脂蛋白组(dil-oxldl)，脂蛋白+绿萝花组(dil-oxldl+eg)，脂蛋白标记了dil荧光，终浓度为10μg/ml，绿萝花浓度为1μg/ml；设置4个时间点，30min，60min，90min和120min；培养结束后，弃培养基，酸性pbs洗4次，每次5min；胰酶消化5min，弃消化液，加入培养基把细胞吹下来；离心，1000rpm，3min；弃上清，pbs重悬细胞；转移到流式上样管中，流式细胞仪开机之后，以空白组为基准，调节电流和电压，圈住的细胞设为阴性细胞群，无荧光表达，以此为门，门外细胞群为阳性细胞群，带有荧光标记，上样结束之后统计阳性细胞数和平均荧光强度。

结果如图7所示，绿萝花并不影响氧化低密度脂蛋白与细胞之间的相互结合。

实施例9.绿萝花对泡沫细胞中参与胆固醇转运相关基因表达水平的影响

12孔板提前铺好细胞，每孔铺4×10^5个bmdm细胞，设置组别：空白组(vehicle)，脂蛋白组(ox-ldl)，脂蛋白+绿萝花组(ox-ldl+1μgeg)，脂蛋白的终浓度为40mg/ml，药物刺激6h；弃培养基，pbs洗2遍；将12孔板置于冰上，每孔加入1mltrizol裂解液；将孔板内的液体转移至1.5ml离心管中，冰上静置5min；每孔加入0.2ml氯仿，振荡混匀30秒，冰上静置10min；离心，12000rpm，10min，4℃；取0.4ml上清到新的离心管；加入等体积的异丙醇，上下颠倒数下，室温静置10min；离心，12000rpm，10min，4℃；弃上清，加入1ml75％乙醇洗涤rna沉淀；离心，12000rpm，5min，4℃；弃上清，吸去残余液体，烘干；加入20μldepc水，金属浴60℃5min；取1μg总rna逆转录成cdna，以此cdna为模板进行下一步的荧光定量pcr，检测actin、cd36、sr-b1、abca1和abcg1相关基因的表达水平。

结果如图8所示，与模型组(ox-ldl)相比，绿萝花处理后cd36和sr-b1的基因表达具有下降趋势，但abca1和abcg1基因表达无差异。据此我们推测绿萝花总提物可能在胆固醇排出方面不发挥主要作用。

本发明的工作原理：。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。