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一种姜花苯环型酯类花香基因HcBSMT及其应用的制作方法

花匠小妙招
2024-09-17 03:40

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt及其应用。

背景技术：

花香是观赏植物重要的审美和商品性状之一，近年来越来越受到人们的重视。研究表明，与无香味的品种相比，消费者更加钟爱具有芳香气味的花卉品种（picherskyetal.,2007）。据现代医学研究表明，许多植物的花香可以使人身心愉悦、神志安宁、缓解疲劳、振奋精神，起到一定保健和治疗疾病的作用（杨徐杭等，2001）。另外，香花香草植物还可以用来提取植物精油，广泛应用于化妆品和制药行业，具有较大的商业价值。

花香是许多低分子量、低沸点、易挥发的亲脂性分子组成的复杂混合物（dudarevaetal.,2008）。到目前为止，在超过1000种植物中，鉴定出了超过1700种挥发性香气物质（knudsenetal.,2006）。其中，苯环型酯类化合物是组成花香的一类重要挥发性物质，尤其苯甲酸甲酯和水杨甲酯是组成花香的重要成分，它们存在于超过100种植物的花香中（effmertetal.,2005）。苯甲酸甲酯的生物合成起始于芳香族氨基酸苯丙氨酸，生物合成的第一个关键步骤是由苯丙氨酸解氨酶（pal）催化，pal使苯丙氨酸脱去氨基形成反式肉桂酸（wildermuth,2006）。由反式肉桂酸转变成挥发性的苯环类化合物需要从丙基侧链上去掉两个碳单元，该反应过程可以由两个独立的催化途径来完成，β-氧化途径和非β-氧化途径（boatrightetal.,2004）。目前，对于β-氧化途径，反式肉桂酸在过氧化物酶体atp-结合盒式转运蛋白（pxas）的作用下，从胞质运输至过氧化物酶体（busselletal.,2014），然后由肉桂酰辅酶a连接酶（cnl）将反式肉桂酸硫酯化（colquhounetal.,2012；klempienetal.,2012），再通过肉桂酰辅酶a水合脱氢酶（chd）完成水化和脱氢步骤（qualleyetal.,2012），最后在酮酯酰辅酶a硫解酶（kat）的催化下形成苯甲酰辅酶a（vanmoerkerckeetal.,2009）。对于非β-氧化途径，则以苯甲醛为重要的中间产物，通过苯甲醛脱氢酶（baldh）将苯甲醛氧化成苯甲酸（longetal.,2009），然而，反式肉桂酸形成苯甲醛的过程尚不清楚。在最后阶段，sabath家族的甲基转移酶则将s-腺苷甲硫氨酸（sam）的甲基基团转移到苯环型羧酸上，形成具有芳香气味的苯环型酯类花香物质（d'auriaetal.,2003）。

sabath是植物特有的甲基转移酶家族，催化植物小分子的n原子或羧基基团的甲基化，它们的序列与其它类型的甲基转移酶有很大差异，因此，形成了一类新的甲基转移酶，分别提取三个最早发现的成员名字的两个英文字母，命名为sabath家族，这三个最早发现的成员分别是水杨酸甲基转移酶（samt）、苯甲酸甲基转移酶（bamt）和可可碱合酶（d'auriaetal.,2003）。仙女扇samt是该家族中最早被发现的成员，它催化水杨酸和sam形成水杨酸甲酯（rossetal.,1999）。金鱼草bamt利用苯甲酸生成苯甲酸甲酯（murfittetal.,2000）。一些sabath家族成员具有双功能性，即同时具有samt和bamt的活性，因此，称其为水杨酸/苯甲酸甲基转移酶（bsmt）（chenetal.,2003；pottetal.,2004）。bsmt是苯甲酸甲酯生物合成的末端酶，在苯甲酸甲酯生物合成中发挥着重要的调控作用。目前，国外研究人员也仅在拟南芥（chenetal.,2003）、矮牵牛（negreetal.,2003）和观赏烟草（hippaufetal.,2010）等几种双子叶植物中鉴定到该酶，而在单子叶植物中报道较少。

技术实现要素：

目前，国内对sabath甲基转移酶与花香形成的研究鲜见报道，直到本专利申请前没有发现对姜花苯环型酯类花香基因的报道。克隆花香基因是研究姜花花香形成机理的前提，揭示姜花花香形成的分子机理可为增加花香提供理论依据。这为采用基因工程的方法培育具浓郁花香植物新品种提供了一条崭新的途径。本发明的目的是分离克隆姜花中携带的一个控制苯环型酯类花香成分苯甲酸甲酯的基因hcbsmt。

本发明另一目的在于提供上述基因编码的蛋白质。。

本发明另一目的在于提供含有上述基因的表达载体。

本发明还有一个目的在于提供上述基因在产生分子标记及其在选育花香品种中的应用，在培育转基因花香植株中的应用，以及上述基因编码的蛋白质在制备香精和药物中的应用。

本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：

一种姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt，所述基因的全长cdna序列如seqidno:1所示，全长cdna序列长1422bp；基因的全长dna序列如seqidno:2所示，全长dna序列长1797bp。

姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt赋予姜花花朵苯甲酸甲酯香味，而且姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt在有香味的姜花组织表达，在无香味的姜花组织中不表达，并且其表达与花发育进程呈显著正相关。该基因编码序列（cds）如seqidno：3所示，共1134bp，推测其编码377个氨基酸，其序列如seqidno:4所示，蛋白分子量为43kda，在这个基因序列中有多个保守的sam和苯基羧酸底物结合位点。dna序列长度为1506bp，包含4个内含子，分别位于第82～167位、306～405位、679～785位、1059～1140位，剪切位置均符合“gt-ag法则”。

同时，本发明还提供一对用于扩增姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt的引物，引物序列如seqidno:5～6所示。

一种重组载体，包含上述姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt。

一种包含权利要求5所述重组载体的重组菌。

一种包含权利要求5所述重组载体的细胞系。

本发明姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt编码的蛋白质在体外或植物体内均可催化苯甲酸和sam反应生成苯甲酸甲酯，催化水杨酸和sam反应生成水杨酸甲酯，其在25°c和ph6.5条件下表现出最大的催化活性，对底物苯甲酸和水杨酸的km值分别为87.73±7.03和26.73±3.88µm。

如上所述姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt的应用，具体为将姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt连接到植物转化载体中，然后导入姜花或其它植物细胞中，获得表达所述姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt的具花香转基因品种。

如上所述姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt的应用，具体为根据该基因产生特异性的分子标记，用于鉴定具有苯环型酯类花香的姜花属杂交后代。

如上所述姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt编码的蛋白质在制备香精和/或药物中的应用。

本发明同样包括将hcbsmt花香基因的主要结构部分有效地连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒的35s启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称为诱导型启动子。因此，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达，同样，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗性反应得到人为的控制。其中环境条件包含病虫害的攻击、高低温和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。

根据本发明提供的hcbsmt基因序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与hcbsmt等同的基因：（1）通过数据库检索获得；（2）以hcbsmt基因片段为探针筛选姜花或其它植物的基因组文库或cdna文库获得；（3）根据hcbsmt基因序列信息设计寡核苷酸引物，用pcr扩增的方法从姜花或其它近缘植物的基因组、mrna和cdna中获取；（4）在hcbsmt基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；（5）用化学合成的方法获得该基因。

本发明提供的姜花花香基因hcbsmt具有重要的应用价值。应用之一是将所述的hcbsmt基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将hcbsmt花香基因导入姜花或其他植物细胞，可获得具花香的转基因植株，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物产生花香和增强抗性的能力。

本发明提供的花香基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于snp（单核苷酸多态）、ssr（简单序列重复多态）、rflp（限制性内切酶长度多态）、cap（切割扩增片段多态）。用这些标记可鉴定姜花属及其杂交子代的花香基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明获得了姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt是姜花花香主成分苯甲酸甲酯生物合成和释放的关键基因；该基因编码的蛋白质在体外或植物体内均可催化苯甲酸和sam反应生成苯甲酸甲酯，催化水杨酸和sam反应生成水杨酸甲酯；将该花香基因转入无花香的植物，有助于产生新的花香植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个花香基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。花香基因的克隆是克服传统育种中不能在植物种间转移花香基因的问题的前提。另外，本发明能够进一步提供或应用利用上述dna片段获得的花香的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株。

附图说明

图1为苯甲酸甲酯在姜花中的释放规律及hcbsmt的基因表达分析；a：苯甲酸甲酯在姜花不同器官的释放规律；b：苯甲酸甲酯在不同花发育时期的释放规律；c：hcbsmt在姜花不同器官的表达分析；d：hcbsmt在花瓣不同发育时期的表达分析；ss：花柱和柱头；a：花药；f：花丝；l：唇瓣；lp：侧瓣；se：萼片；pe：花梗；b：苞片；le：叶片；ri：根茎。

图2为hcbsmt重组蛋白体外功能分析；a和b：hcbsmt催化苯甲酸（ba）和水杨酸（sa）生成产物的总离子色谱图和质谱图；c：苯甲酸甲酯的总离子色谱图和质谱图；d：水杨酸甲酯的总离子色谱图和质谱图；e和f：空载体对照。

图3为烟草叶片瞬时转化鉴定hcbsmt功能；a和b：egfp作为阴性对照，；c和d：烟草叶片瞬时转化hcbsmt及注射苯甲酸（ba）和水杨酸（sa）底物生成产物的选择离子色谱图；e：苯甲酸甲酯的选择离子色谱图；f：水杨酸甲酯的选择离子色谱图。

图4为hcbmst蛋白的生化分析；a：温度对hcbmst催化活性的影响分析；b：ph对hcbmst催化活性的影响分析；c：hcbmst催化底物苯甲酸的酶动力学分析；d：hcbmst催化底物苯甲酸的酶动力学分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法均为本领域常规使用的试剂和方法。

实施例1hcbsmt基因cdna和dna全长的获得

s1.姜花花瓣rna的提取：姜花花瓣rna的提取采用trizol法。称取0.1g花瓣材料于液氮中迅速研磨成粉末，转入含有1.0mltrizol的离心管中，剧烈振荡混匀，室温静置5min。于4°c12,000g离心5min。小心吸取上清液，移入新的离心管中，加入200μl氯仿，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5min。12,000g4°c离心15min。吸取上清液转移至另一新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min。12,000g4°c离心10min。小心弃去上清，用75%乙醇，洗涤沉淀2～3次，7,500g4°c离心5min后，小心弃去上清。打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的rnase-free水溶解沉淀。

s2.cdna第一链的合成：以姜花花瓣总rna作为模板，利用m-mlv反转录酶合成第一链cdna。在微量离心管中加入1000ngtotalrna、1μloligod(t)18primers、1μldntp(10mmeach)，补充rnase-freeh2o至10μl。轻轻混匀，离心数秒后，70°c水浴10min，立即冰浴2min。依次加入4μl5×m-mlvbuffer、0.5μlrnaseinhitor(40u/μl)、1μlm-mlv反转录酶，补充rnase-freeh2o至20μl。稍离心，42°c水浴60min，70°c水浴15min灭活逆转录酶，冰上冷却2min，-20°c保存备用。

s3.cdna全长克隆：合成基因全长克隆引物hcbsmt-f：cccgtagttccatgctccat，如seqidno:5所示；hcbsmt-r：gtttcaatttacgtccacatcagc，如seqidno:6所示。以姜花cdna为模板，采用高保真dna聚合酶kod-plus（toyobo）进行pcr扩增反应。反应条件为：94°c，预变性3min；98°c，变性10s，68°c，退火/延伸2min，40个循环；最后68°c，延伸10min。使用tbe缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，然后将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切出含有目的dna的琼脂糖凝胶，使用上海生工的胶回收试剂盒进行胶回收，使用40μl洗脱液洗脱回收产物。使用rtaqdna聚合酶（takara）对回收产物进行加a尾反应，反应条件为72°c保温30min。连接载体使用pmd19-t（takara），16°c连接过夜。将10μl连接产物与100μl大肠杆菌感受态细胞dh5α混合，冰浴30min。42°c热激90s，迅速冰浴2min。加入1ml液体lb，混合后于37°c摇床摇动1h。离心去上清液，在含100μg/mlamp的lb固体培养基平板表面涂40µl的x-gal（20mg/ml）和4µliptg（200mg/ml），然后涂布适量转化液。37°c倒置培养12～16h。用灭菌的枪头从lb固体培养基上挑取白色单菌落接种于含有100μg/mlamp的lb液体培养基中，于控温水浴摇床上37°c、180rpm过夜培养。使用上海生工的质粒小提试剂盒抽提过夜培养细菌的质粒，对所抽提质粒进行双酶切鉴定。利用m13测序引物对阳性克隆进行测序分析，获得hcbsmt基因的全长cdna序列，如seqidno:1所示，其编码序列（cds）如seqidno:3所示，推测其蛋白氨基酸序列，如seqidno:4所示。

s4.dna序列克隆：使用植物基因组dna提取试剂盒（tiangen）提取姜花花瓣或叶片基因组dna。利用与s3中相同的克隆引物，以基因组dna为模板，在kod-plus聚合酶作用下进行pcr扩增，pcr反应条件以及后续克隆步骤同s3,获得hcbsmt的基因组dna序列，如seqidno:2所示。

实施例2姜花苯环型酯类花香物质测定和hcbsmt的基因表达分析

s1.姜花苯环型酯类花香物质测定：将待测样品密封于测气装置中，同时加入1.728μg葵酸乙酯作为内标，收集花朵香气物质和内标物质30min后，插入50/30μmdvb/car/pdms萃取头（supelco）萃取30min，然后进行gc-ms检测并称量样品。气相色谱（agilent7890agcsysterm）条件为：色谱柱为hp-5ms(30m×0.25μm)；载气为高纯氦气，进样口温度为250°c，不分流进样，柱流量1ml/min，解析时间为3min。程序升温：柱起始温度40°c，保持2min，以10°c/min的速度升至250°c保持5min。质谱（agilent5975cmsd）条件为：接口温度220°c，电子轰击源ei电压为1000v，离子源温度230°c，电子能量70ev，扫描质量范围50～335aum，采集到的质谱信息使用nist库中标准质谱进行匹配分析。香气成分计算公式为：组分含量（μg•gfw-1•h-1）=内标质量×组分峰面积/内标物峰面积/花朵鲜重。

s2.hcbsmt的基因表达分析：使用植物总rna提取试剂盒（magen）进行姜花不同部位样品总rna的抽提；使用trizol法抽提花瓣不同发育时期样品的总rna，具体方法同“实施例1s1”。取1μg总rna利用primescript反转录试剂盒（takara）进行rna反转录，将反转录所得的cdna产物稀释20倍后用于实时荧光定量pcr。利用primerpremier5.0软件在hcbsmt基因的3’非翻译区设计荧光定量pcr引物，上游引物f：aggagaaagccaatcacacc，如seqidno:7所示；下游引物r：ggcatgattcagtttgacaag，如seqidno:8所示。引物的特异性通过凝胶电泳、测序和溶解曲线检验，使用标准曲线法检测每对引物的扩增效率和相关系数。试验使用abi7500荧光定量pcr系统，反应体系为20μl，其中包含10μlitaquniversalsybrgreensupermix(bio-rad)、0.2μm上/下游引物、2μlcdna模板和适量纯水。反应程序为95°c预变性30s，随后95°c变性15s，55°c退火30s，72°c延伸30s，40个循环，溶解曲线程序为从60°c开始，以1%的升温速度至95°c。每个样品进行三次技术重复。姜花不同部位表达分析使用前期筛选的act作为内参基因进行样品间基因表达的均一化处理，上游引物f：gtatgttgctattcaggctgtcc，如seqidno:9所示；下游引物r：gaagaatggcatgaggtagagc，如seqidno:10所示。姜花花瓣不同发育时期表达分析使用前期筛选的rps作为内参基因进行样品间基因表达的均一化处理，上游引物f：ttagtagcatcggctgcaataag，如seqidno:11所示；下游引物r：ctcttttgggaagacggttgag，如seqidno:12所示。采用2－△△ct法（livaketal.,2001）计算不同样品间的相对表达情况。

苯环型酯类花香物质测定和基因表达分析结果见图1。从图中可以看出：姜花花香成分中的主要苯环型酯类花香物质为苯甲酸甲酯。苯甲酸甲酯主要的释放部位为侧瓣、唇瓣、萼片和花丝，另外，花柱和柱头、花药和花梗也有少量释放，而苞片、叶片和根茎则检测不到苯甲酸甲酯的释放。在花发育过程中，花蕾期（0～16h）几乎检测不到苯甲酸甲酯的释放，在初开期（24h）有微量的苯甲酸甲酯检出，随着花的开放到盛开期（40h）苯甲酸甲酯的释放量逐渐增多，而48h和56h的释放量有所降低，在衰老期（64h）苯甲酸甲酯释放量达到最高。荧光定量pcr分析表明，hcbsmt基因在花器官特异表达，其中在唇瓣、侧瓣和萼片中表达量较高，而在非花器官部位（苞片、叶片和根茎）几乎不表达。在花发育过程中，hcbsmt基因在0h到24h花瓣发育过程中几乎均不表达；从花瓣半开期（32h）开始，基因表达迅速增加，在盛开期和衰老期（40～64h）保持较高的表达水平。以上结果显示，hcbsmt基因的表达与苯甲酸甲酯的释放呈极显著相关，说明hcbsmt是姜花花香主成分苯甲酸甲酯生物合成和释放的关键基因。

实施例3hcbsmt体外功能分析

s1.载体构建：根据hcbsmt基因的cdna序列，设计包含ecori和noti酶切位点的特异引物，上游引物f：gaattcatgggtttgaaggtggagca，如seqidno:13所示；下游引物r：gcggccgcatactcttttcttcaaggcaatgac，如seqidno:14所示。利用高保真酶kod-plus进行pcr扩增，将扩增产物回收后，和pet-30a载体同时在37°c下双酶切3h，酶切结束后将dna片段进行纯化。将纯化后的目的片段和载体利用t4dna连接酶，在16°c进行过夜连接，将连接产物转化入e.colidh5α感受态，测序确定无误后，将重组质粒转入rosetta2（de3）plyss菌株。

s2.重组蛋白表达和纯化：挑取单菌落接种于5mllb（含50mg/lkan，34mg/lchl）液体培养基中，37°c震荡培养过夜。转接100µl种子液于新鲜的100ml（含50mg/lkan，34mg/lchl）的lb液体培养基中，37°c180rpm培养至od值为0.4～0.6，加入0.02mmiptg，16°c诱导24～48h。离心收集菌体，用5ml裂解缓冲液（50mmnah2po4，300mmnacl，10mm咪唑，ph8.0）悬浮细胞，置于冰上超声波破碎细胞三次，每次5min。12000rpm，4°c离心10min，将上清移至新的离心管中，用双蒸水清洗沉淀一次，再用5ml裂解缓冲液悬浮沉淀。分别取上清和沉淀各15µl，进行sds-page电泳分析。

s3.重组蛋白纯化：在层析柱中装入0.5mlni-ntahis•bindresins（novagen），4°c垂直静置过夜，待树脂沉淀好后，流干内部液体，加入5ml的双蒸水，反复冲洗5～10次，4°c预冷。将5ml细胞裂解上清液加入预冷的层析柱中，充分混匀，并低速在4°c摇床上结合1h。将液体流出，收集于15ml离心管中，取15µl的流出液，进行sds-page分析。加入4ml的洗涤缓冲液（50mmnah2po4，300mmnacl，20mm咪唑，ph8.0），洗涤层析柱两次，收集每部分的洗涤液，标记为w1、w2，各取15µl进行sds-page分析。分别用0.5ml的洗脱缓冲液（50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑，ph8.0）洗柱四次，分别用不同的收集管依次收集每部分的洗脱液，分别标记为e1、e2、e3、e4，各取15µl进行sds-page分析。根据sds-page的检测结果，用移液器将纯度及浓度较高的洗脱部分转移至透析袋中，4°c过夜透析2次。利用牛血清蛋白制作标准曲线，测定纯化样品的蛋白浓度。

s4.酶催化功能鉴定：在玻璃反应瓶中配制1ml反应液（50mmtris-hcl，ph7.0、0.2mmsam、100mmkcl、2mm苯甲酸或水杨酸和10µg纯化的重组蛋白），密封后，25°c水浴1h。将50/30μmdvb/car/pdms萃取头（supelco）插入密封的反应瓶中，50°c水浴顶空固相微萃取30min后，将萃取头插至gc-ms进样口中进行分析，气相色谱和质谱条件同“实施例2s1”。通过比对反应产物和标准品的保留时间和质谱图确定甲基化产物种类。

s5.酶催化活性分析：酶催化活性分析的标准反应体系和反应条件同s4，将反应液置于不同温度条件下，分析不同温度对酶催化活性的影响。配制不同ph的50mmtris-hcl缓冲液，分析不同ph对酶催化活性的影响。分别以不同浓度的苯甲酸（0～500µm）和水杨酸（0～500µm）为底物，分析hcbsmt对底物苯甲酸和水杨酸的酶动力学特性。

酶催化功能分析和催化活性分析结果见图2和4。从图2可以看出：hcbsmt可催化苯甲酸和sam反应生成苯甲酸甲酯，也可催化水杨酸和sam反应生成水杨酸甲酯，而空白对照则无甲基化产物检出，说明hcbsmt为苯甲酸/水杨酸甲基转移酶。从图4可以看出：hcbsmt在25°c和ph6.5条件下表现出最大的酶催化活性，对底物苯甲酸的km值为87.73±7.03µm，对底物水杨酸的km值为26.73±3.88µm。

实施例4hcbsmt瞬时转化烟草叶片

s1.载体构建及农杆菌转化：根据hcbsmt基因的cdna序列，设计包含saci和kpni酶切位点的特异引物，上游引物f：gagctcatgggtttgaaggtggagca，如seqidno:15所示；下游引物r：ggtaccttatactcttttcttcaaggcaatg，如seqidno:16所示。利用高保真酶kod-plus进行pcr扩增，将扩增产物回收后，双酶切连入pgreenii62-sk载体，转化dh5α，测序确定无误后，将重组质粒转入农杆菌gv3101psoup菌株。

s2.农杆菌培养和烟草瞬时转化：挑取农杆菌单菌落接种于含rif（50μg/ml）+kan（50μg/ml）的lb液体培养基中，28°c200rpm震荡培养~24h。5,000g离心10min，弃上清，用纯水悬浮菌液后，5,000g离心10min，弃上清。用渗透缓冲液（10mmmes，ph5.2、10mmmgcl2、0.1mm乙酰丁香酮）重悬农杆菌至od600约为0.4，室温下放置3h。1ml无针头注射器吸取农杆菌悬浮液对烟草叶片进行渗透浸染，侵染后放置于培养室中继续培养。

s3.烟草叶片挥发物检测：培养3d后，用1ml无针头注射器对已浸染农杆菌的烟草叶片渗透注射1mm苯甲酸或水杨酸，将整株烟草密闭于500ml的玻璃瓶中，固相微萃取法萃取烟草挥发物6～12h，随后进行gc-ms分析，气相色谱和质谱条件同“实施例2s1”。通过比对反应产物和标准品的保留时间和质谱图确定甲基化产物的种类。

烟草叶片的挥发物成分的检测结果见图3，从图3可以看出：瞬时转化egfp后，荧光显微镜下可以观察到大量的绿色荧光信号，说明此转化体系具有较高的转化效率。瞬时转化hcbsmt基因，同时注射底物苯甲酸后，叶片挥发物中可以检测到大量苯甲酸甲酯生成；瞬时转化hcbsmt基因，同时注射底物水杨酸后，叶片挥发物中可以检测到大量水杨酸甲酯生成。说明hcbsmt在植物体内也具有催化苯甲酸生成苯甲酸甲酯，催化水杨酸生成水杨酸甲酯的功能。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种姜花苯环型酯类花香基因hcbsmt及其应用

<130>1713511zbsh042

<141>2017-10-17

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1422

<212>dna

<213>百合(liliumbrowniivar.viridulum)

<400>1

cccgtagttccatgctccataaacctcacatttcatactcaccaaatcctcaggccctca60

gaagagtgtgtgtgtgagagagagggagaaagatgggtttgaaggtggagcaagctcttc120

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技术特征：

技术总结
本发明公开了一种姜花苯环型酯类花香基因HcBSMT及其应用。所述HcBSMT基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；全长DNA序列如SEQ ID NO:2所示；编码序列如SEQ ID NO:3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。HcBSMT基因在有香味的姜花组织中表达，在无香味的姜花组织中不表达，其表达受花发育的调控，并且表达模式与花香释放相关。将HcBSMT基因导入姜花或其它植物细胞中，可获得表达所述基因的具花香转基因植株；也可以根据其基因序列信息产生特异性的分子标记，用于鉴定姜花属及其杂交子代的花香基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率，具有较大的应用前景。

技术研发人员：范燕萍;岳跃冲;余让才;何杰玲;李昕悦;玉云祎
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2017.10.17
技术公布日：2018.02.02