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一种粗梗水蕨的孢子繁殖方法.pdf

花匠小妙招
2025-01-16 23:52

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810784915.4 (22)申请日 2018.07.17 (71)申请人湖南先导洋湖再生水有限公司地址 410208 湖南省长沙市岳麓区洋湖路 689号 (72)发明人王文明危建新尹振文左锋宋凤鸣 (74)专利代理机构长沙正奇专利事务所有限责任公司 43113 代理人马强蒋尊龙 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) A01G 31/00(2018.01) (54)发明名称一种粗梗水蕨的孢子繁殖方法 (57)摘要本发明公开。

2、了一种粗梗水蕨的孢子繁殖方法，包括以下步骤：将粗梗水蕨的孢子消毒，消毒后用无菌水配制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于添加有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸的MS培养基中进行培养； MS培养基中， 6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.05-0.15mg/L，萘乙酸的浓度为0.02- 0.1mg/L；粗梗水蕨的孢子培养至萌发出原叶体后，转接到添加有吲哚丁酸的MS培养基中进行培养， MS培养基中吲哚丁酸的浓度为0.1-0.3mg/L，培养至长出2-4片叶片，得到试管苗；将试管苗取出，移栽后进行培养，得到粗梗水蕨植株。接种在添加了6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸的MS培养基中，孢。

3、子萌发率高，达到了60以上，原叶体发育成幼孢子体的概率也较高，提高了增殖系数和大量扩繁速度。权利要求书1页说明书5页附图3页 CN 109006477 A 2018.12.18 CN 109006477 A 1.一种粗梗水蕨的孢子繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)将粗梗水蕨的孢子消毒后，用无菌水配制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于添加有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸的MS培养基中进行培养； MS培养基中， 6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.05-0.15mg/L，萘乙酸的浓度为0.02-0.1mg/L； (2)粗梗水蕨的孢子培养至萌发出原叶体后，转接到添加有吲哚丁。

4、酸的MS培养基中进行培养， MS培养基中吲哚丁酸的浓度为1-1.5mg/L，培养至长出2-4片叶片，得到试管苗； (3)将试管苗取出，移栽后进行培养，得到粗梗水蕨植株。 2.如权利要求1所述的孢子繁殖方法，其特征在于，步骤(1)中， MS培养基中， 6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.1mg/L，萘乙酸的浓度为0.05mg/L。 3.如权利要求1所述的孢子繁殖方法，其特征在于，步骤(3)中，将试管苗移栽至经过消毒的培养土中，所述培养土由以下组分组成： 65-75wt泥炭、 15-25wt稻壳炭、 8-12wt 蛭石。 4.如权利要求3所述的孢子繁殖方法，其特征在于，采取。

5、浸盆给水的方式，控制培养土的湿度在7595。 5.如权利要求1所述的孢子繁殖方法，其特征在于，步骤(3)的培养过程中，采用8- 12mg/L的纳米硅肥溶液进行叶面喷施，每周喷施一次。 6.如权利要求1所述的孢子繁殖方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，培养条件为27.5- 28.5，光照度20002500lx，光照1214小时/天。 7.如权利要求1所述的孢子繁殖方法，其特征在于，步骤(1)中，消毒的具体条件为：将粗梗水蕨的孢子在体积分数70-75的乙醇中浸泡8-15s，再在质量分数1.5-2.5的次氯酸钠中浸泡8-12min。 8.如权利要求1所述的孢子。

6、繁殖方法，其特征在于，孢子悬浮液中孢子的密度为： 1106 个/mL。 9.如权利要求1所述的孢子繁殖方法，其特征在于，粗梗水蕨的孢子的采集方式为：采摘下有成熟孢子的叶片，在3-5的干燥条件下保存至孢子逐渐散落。 10.如权利要求1-9任一项所述的孢子繁殖方法，其特征在于，步骤(1)中，用吲哚丁酸代替6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸， MS培养基中，吲哚丁酸的浓度为0.8-1.2mg/L。权利要求书 1/1 页 2 CN 109006477 A 2 一种粗梗水蕨的孢子繁殖方法技术领域 0001 本发明涉及一种粗梗水蕨的孢子繁殖方法，属于水生植物培育领域。背景技术。

7、 0002 水蕨科(Ceratopteridaceae)所有植物均为二级保护植物，其叶二型，形态变化较大，同时可食用和药用，具独特的景观价值和生态学意义。但由于水蕨类对所生活环境的水质要求相对较高，在污染较多的水域无法生长，因此野生植株越来越少见。 0003 目前水蕨(Ceratopteris thalictroides(L.)Brongn.)已有快繁方法的报道，申请号为CN201210075022.5的发明专利濒危蕨类植物水蕨的繁育方法公布了一种通过水蕨孢子采集、接种于培养皿，在人工气候箱中培养获得幼苗的人工繁育方法，申请号为 CN201410734844.。

8、9的发明专利一种快速繁殖水蕨种苗的方法公布了一种将水蕨的孢子接种到萌发培养基培养成幼苗、将幼苗切段后插入培养基中培养出幼芽，再将幼芽切成段进行继代培养，将幼芽接种到生根培养基培养至生根获得水蕨种苗的方法。 0004 目前水蕨已有少量人工繁育苗在市场流通。粗梗水蕨 (Ceratopteris pteridoides(Hook.)Hieron.)相对水蕨更为少见，且尚处于野生状态，尚未被人工繁育开发。粗梗水蕨孢子叶可产生大量孢子，但孢子成熟时间不定，成熟后迅速飘散，难以采集，孢子寿命短，自然环境下萌发率低。而且，粗梗水蕨幼苗冬季耐寒性差，极易冻死，成苗。

9、率低；幼苗还对污染物、农药等较为敏感，在人为干扰多的环境下较难成苗。当期严重的环境污染更让粗梗水蕨野生种群量逐渐减少，濒临灭绝，亟需做好迁地保护和人工繁育。发明内容 0005 本发明解决的技术问题是，粗梗水蕨孢子叶可产生大量孢子，成熟后迅速飘散，难以采集，孢子寿命短，自然环境下萌发率低。因此，为扩繁培育更多粗梗水蕨种苗，针对粗梗水蕨进行组织培养实验研究，筛选出适宜该植物的快繁培养基以及培养方法。 0006 本发明的技术方案是，提供一种粗梗水蕨的孢子繁殖方法，包括以下步骤： 0007 (1)将粗梗水蕨的孢子消毒后，用无菌水配制成孢子悬浮液，将孢子悬浮。

10、液接种于添加有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸的MS培养基中进行培养； MS培养基中， 6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.05-0.15mg/L，萘乙酸的浓度为0.02-0.1mg/L； 0008 (2)粗梗水蕨的孢子培养至萌发出原叶体、幼孢子体后，转接到添加有吲哚丁酸的 MS培养基中进行培养，培养至长出2-4片叶片，得到试管苗， MS培养基中吲哚丁酸的浓度为 0.8-1.2mg/L； 0009 (3)将试管苗取出，移栽后进行培养，得到粗梗水蕨植株。 0010 优选地，步骤(1)中， MS培养基中， 6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.1mg/L，萘乙酸的浓度为0.05mg/L。 0011 。

11、优选地，步骤(3)中，将试管苗移栽至经过消毒的培养土中，所述培养土由以下组分组成： 65-75wt泥炭、 15-25wt稻壳炭、 8-12wt蛭石。说明书 1/5 页 3 CN 109006477 A 3 0012 优选地，采取浸盆给水的方式，控制培养土的湿度在7595。 0013 优选地，步骤(3)的培养过程中，采用8-12mg/L的纳米硅肥溶液进行叶面喷施，每周喷施一次。 0014 优选地，步骤(1)和(2)中，培养条件为27.5-28.5，光照度20002500lx，光照12 14小时/天。 0015 优选地，步骤(1)中，消毒的具体条件为：将粗梗。

12、水蕨的孢子在体积分数70-75的乙醇中浸泡8-15s，再在质量分数1.5-2.5的次氯酸钠中浸泡8-12min。粗梗水蕨孢子体积小，选用毒性较强的消毒剂或消毒时间过长均会影响其活性。采用乙醇10s+次氯酸钠10min 的处理方法能有效消毒。 0016 优选地，孢子悬浮液中孢子的密度为： 1106个/ml。取孢子悬浮液至显微镜下观察，加无菌水调节孢子密度，直至在40倍视野中有50个孢子为宜。 0017 优选地，粗梗水蕨的孢子的采集方式为：采摘下有成熟孢子的叶片，在3-5的干燥条件下保存至孢子逐渐散落。 0018 优选地，步骤(1)中，用吲哚丁酸代替萘乙酸， MS。

13、培养基中，吲哚丁酸的浓度为0.8- 1.2mg/L。 0019 MS培养基： MS培养基由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成，其组成是已知的。在MS培养基添加碳源和琼脂。碳源使用蔗糖，浓度为8-12g/L，优选如10g/L；琼脂的浓度 5-9g/L，优选如7g/L。 0020 下面对本发明作进一步解释： 0021 1、孢子的采集需要持续观测，待孢子囊颜色逐渐加深、孢子叶水分减少时，采摘下有成熟孢子的叶片，将其放在信封或对折的纸袋中干燥保存至孢子逐渐散落， 4低温保存，保存时间不宜超过6个月。 0022 2、消毒。将孢子用滤纸包裹，将滤纸包采用75。

14、乙醇处理10s和2次氯酸钠处理 10min的方式消毒，无菌水冲洗，将滤纸上的孢子粉冲洗至灭菌离心管中，取孢子悬浮液至显微镜下观察，加无菌水调节孢子密度，直至在40倍视野中有50个孢子为宜。 0023 3、无菌接种。配置添加0.1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.05mg/L萘乙酸的MS培养基，接种灭菌孢子液，诱导产生原叶体；培养条件设置为28，光照强度20002500lx，光照12 14小时/天。 0024 4、生根诱导。待原叶体长出幼孢子体后，取出分离成小块，准备转接。接种至添加 1mg/L吲哚丁酸的MS培养基，培养成试管苗。培养条件设置为28，光照。

15、度20002500lx，光照1214小时/天。 0025 5、出瓶炼苗。待长出2-4片真叶，将试管苗取出，根部洗净，种植于经过消毒处理的特定培养土(泥炭+稻壳炭+蛭石，用1多菌灵消毒)中。移栽前期要适当遮阴，采取浸盆给水的方式，控制土壤湿度在7595。其中，稻壳炭即稻壳经过炭化后的产物。 0026 6、施肥管理。采用叶面喷施纳米硅肥，每周喷施一次，提高抗性和存活率。 0027 本发明的有益效果是，接种在添加了0.1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.05mg/L萘乙酸的MS培养基中，孢子萌发率高，达到了65以上；原叶体发育成幼孢子体的概率也较高，达。

16、到了85以上，孢子无菌接种后1周左右即可萌发， 2周左右便可长出原叶体， 4周左右便可长出幼孢子体小苗，原叶体经切割后可再诱导增殖，可在短期内达到大量快速繁殖的效果。说明书 2/5 页 4 CN 109006477 A 4 附图说明 0028 图1孢子萌发前期照片。 0029 图2孢子萌发长出原叶体照片。 0030 图3试管苗照片。 0031 图4出瓶炼苗照片。 0032 图5出瓶炼苗放大照片。具体实施方式 0033 下面结合实施例对本发明作进一步说明。 0034 在MS培养基中添加蔗糖、琼脂。添加琼脂是为了使培养基凝固，添加量少会无法凝固，添加过多会使培养基过硬，。

17、不利于后期生根， 6-9g/L的适宜浓度范围有利于外植体培养诱导和后期生根。蔗糖作为常用碳源，其浓度虽然对培养有一定影响，过低可能会营养不足，过高造成试剂浪费， 8-12g/L范围为适宜浓度。经过初步试验发现蔗糖、琼脂浓度与激素浓度变化相比，对诱导率影响程度可忽略不计。所以，实施例的培养基中将蔗糖、琼脂的浓度固定为10g/L和7g/L。 0035 实施例 0036 本实施例提供一种粗梗水蕨的孢子繁殖方法，包括以下具体步骤： 0037 持续观测至粗梗水蕨孢子囊颜色逐渐加深、趋于成熟时，采摘下有成熟孢子的叶片，将其放在信封中干燥保存至孢子逐渐散落， 4低温保。

18、存。 0038 将孢子用滤纸包裹， 75乙醇10s+2次氯酸钠10min，无菌水冲洗6遍，将滤纸上的孢子粉冲洗至灭菌离心管中，取孢子悬浮液至显微镜下观察，加无菌水调节孢子密度，直至在40倍视野中有50个孢子为宜。 0039 将孢子液接种于添加6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.1mg/L的MS培养基，设置培养条件为28，光照度20002500lx，光照1214小时/天。孢子的平均萌发率为58.1。 0040 待孢子萌发出原叶体、长出幼孢子体后，转接至添加1mg/L吲哚丁酸的MS培养基，培养条件同上。 0041 待长出3-4片叶片，将试管苗取出，根部洗净，。

19、种植于经过消毒处理的特定培养土 (70泥炭+20稻壳炭+10蛭石， 1多菌灵消毒)中。移栽前期要适当遮阴，采取浸盆给水的方式，控制土壤湿度在7595。采用10mg/L纳米硅溶液进行叶面喷施，每周喷施一次，可提高叶绿素含量，增强抗性。 0042 不同灭菌方式对无菌接种的污染率和孢子活性有很大影响，采用75乙醇处理 10s和2次氯酸钠处理10min的方式消毒时，污染率相对较低，且不影响孢子活性，如下表所示。 0043 序号灭菌方式污染率/孢子活性 10.1升汞浸泡4min15(部分失活) 20.1升汞浸泡6min0(大部分失活) 30.1升汞浸泡8min0(大部分失活。

20、) 说明书 3/5 页 5 CN 109006477 A 5 475乙醇(10s)+2次氯酸钠(5min)18.5(不影响活性) 575乙醇(10s)+2次氯酸钠(10min)10(不影响活性) 675乙醇(10s)+2次氯酸钠(15min)10(不影响活性) 0044 在接种前期，改变培养条件(培养基与添加的激素)后，孢子萌发率有较大的变化，在添加0.1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤和0.05mg/L萘乙酸的MS培养基中萌发率最高，达65.3 2.4，如下表所示。 0045 序号培养基培养基中添加的激素孢子萌发率() 1MS6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.1mg/L58.。

21、13.2 2MS6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.05mg/L65.32.4 3MS6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+吲哚丁酸1mg/L57.12.5 4MS6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+吲哚丁酸0.05mg/L56.23.3 5MSN6-呋喃甲基腺嘌呤2mg/L50.54.2 61/2MS6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.1mg/L43.25.5 71/2MS6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.05mg/L45.72.2 81/2MS6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+吲哚丁酸1mg/L42.51.6 91/2MS6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L+吲哚丁酸0.05mg/L46。

22、.23.5 101/2MSN6-呋喃甲基腺嘌呤2mg/L38.62.4 11MS不添加40.31.4 121/2MS不添加36.51.1 0046 在后期生根诱导时，改变激素浓度，根系长度有较大差别，在添加1mg/L吲哚丁酸的MS培养基中平均根长最长，达2.80.5cm，如下表所示。 0047 序号培养基培养基中添加的激素出瓶时平均根长(cm) 1MS0.5mg/L吲哚丁酸1.70.3 2MS1mg/L吲哚丁酸2.80.5 3MS1.5mg/L吲哚丁酸2.40.4 4MS0.5mg/L萘乙酸1.50.4 5MS1mg/L萘乙酸2.30.5 6MS1.5mg/L萘乙酸2.10.4 7。

23、MS01.20.3 0048 出瓶炼苗时，施用不同浓度的纳米硅分散剂对叶片叶绿素含量有较大影响，以 10mg/L浓度处理效果最佳，超过该浓度无显著差异，如下表所示。 0049 序号硅肥浓度(mg/L)叶绿素含量(SPAD) 1028.323.41 2228.452.25 3430.232.63 4631.672.14 说明书 4/5 页 6 CN 109006477 A 6 5833.741.29 61035.821.17 71235.351.75 说明书 5/5 页 7 CN 109006477 A 7 图1 图2 说明书附图 1/3 页 8 CN 109006477 A 8 图3 图4 说明书附图 2/3 页 9 CN 109006477 A 9 图5 说明书附图 3/3 页 10 CN 109006477 A 10 。