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想吃桃果？了解结石形成秘密，必须知道木质素和类黄酮的配合！

花匠小妙招
2025-01-17 18:27

果实内果皮层的木质化发生在许多被子植物中，在种子保护和传播中起着关键作用。这一过程已经被广泛研究，与拟南芥的豆荚破碎或裂开有关。裂开由一组转录因子控制，这些转录因子定义了果实组织层以及它们是否木质化。

相比之下，对其他植物的类似过程知之甚少，例如核果，其中含有极其坚硬的木质化内果皮或围绕单个种子的石头。植物已经进化出各种各样的种子保护和传播策略。其中，包括樱桃、桃子、李子、杏和杏仁在内的李子物种已经发展出一种独特的适应性，其中种子被一种非常坚硬的木头状甲壳包裹，称为石头。

石头是通过果实内果皮层的木质化形成的，这一特征定义了更广泛的一类植物，称为核果。芒果、橄榄、咖啡（咖啡属）、椰子、黑莓和开心果都是核果的例子，突出了它们的多样性和农业重要性。

虽然木质素在李子结石中可能特别突出，但木质素沉积在特定果实组织层中是种子保护和传播中反复出现的主题。在某些情况下，子实体结构的木质化进化为保护种子免受疾病和胁迫。

李子的石材硬化机理只在有限的程度上得到了研究。仅检查了结石组织组成和形成中的一种或两种成分或酶，包括Tani等人的两份报告关于FUL，STK和SHP与桃子裂核（裂石）表型的关系：与早熟相关的现象。关于结石组织的生化组成、结石组织如何形成以及结石组织分化是否以与拟南芥的enb发育相同的方式控制结石组织分化，许多基本问题仍未得到解答。

在这里，我们着手确定桃果早期发育过程中结石形成的发育和分子基础。结果表明，PP和木质素途径中的许多基因在木质素沉积开始的同时在结石组织中被诱导。在此期间，类黄酮途径在中果皮和外果皮中也上调，并且可能竞争PP途径衍生的前体。对转录因子的分析表明，桃内果皮分化可能与拟南芥enb层以相同的方式受到调节。总的来说，基因表达数据与其他植物物种的表达数据一起呈现，并且与核果生理学和发育的已知方面一致。

桃内果皮木质素沉积的空间/时间模式

为了确定幼果生长过程中的关键结石发育时间，研究了木质素沉积的时间和模式。结石组织在从生长的I期过渡到II期时变硬，因此有时在该过渡期收集果实并进行染色以检测木质素。在平行于缝合线（通过子房连接形成的从茎到花朵的边缘）解剖的果实中，在开花后37天（DAB）首次检测到从花端辐射的薄组织层中的木质素沉积。

之后，染色在整个内皮层中迅速发展。这些石头在 59 DAB 时开始大幅硬化，此后无法再用刀切割。在果皮以外的组织中观察到很少或没有染色，除了中果皮和果实表面存在的毛状体中分散的小维管元素。在两个时间点（45 DAB和51 DAB）垂直于缝合线解剖水果，这使得从缝合侧开始的木质素沉积可视化和桃石不规则“火焰”特征的形成。这些数据定义了木质素沉积的一般模式，并表明结石木质化过程在果实发育中相对较早地开始。

最近，桃子基因组序列的未发表草案已经可用，使我们能够根据BlastN分析预测哪些苹果阵列寡核苷酸可能与其预期靶标杂交。结果表明，大约80%的苹果阵列寡核苷酸与桃子靶标具有显著的同源性，这与我们的阵列数据比较结果一致。

由寡核苷酸代表的基因给出较差的BlastN评分（<17 bp连续匹配）在最终数据集中被标记，但未消除。这些数据被包括在内，因为低BlastN分数不会使它们无效，因为一些寡核苷酸可以预测地跨越内含子，并且使用的临界分数可能高于实际杂交阈值，该阈值受靶信使RNA丰度，竞争性非靶RNA丰度和Tm.事实上，苹果阵列的重要基因之一，我们后来通过定量聚合酶链反应（qPCR）证实，由于其预期桃子靶标仅具有16 bp连续匹配的寡核苷酸表示。

分析来自桃子和苹果阵列组合数据集的表达数据，以寻找表达模式与木质素沉积时间一致的基因。首先，进行品质因数（FOM）分析以确定解释表达模式中大部分变异所需的聚类数量。

以“热”图的形式比较了这三种途径中所有重要基因的表达模式（如之前通过早期果实发育期间具有统计学意义的表达变化定义）。这些基因中的许多（但不是全部）具有类似于木质素沉积谱的表达谱，木质素沉积谱部分定义为45至51 DAB之间的最大表达，与观察到的木质素染色增殖一致。

通过 qPCR 验证芯片数据

从重要基因列表中，选择12个与已知次级代谢基因具有高度同源性的基因通过qPCR进行进一步验证。这些基因包括三个PP，五个木质素和四个类黄酮途径基因。包括来自另外两个果实发育时间点（23和30 DAB）的cDNA，以获得这些基因的更详细的表达模式。

相对表达计算为相对于从 2 DAB 参考样品的 qPCR 获得的值的 Log87- 倍变化，以便与阵列数据直接比较。来自桃子和苹果阵列平台的数据与基于整体表达模式的qPCR结果非常一致。在特定时间点观察到一些变化，在肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）的情况下，表达最高，为30 DAB，这是阵列实验中未包括的时间点。变异的一个来源可能是由于这些基因中的许多是基因家族的成员，并且阵列数据很可能代表多个基因的组合信号。

木质素和类黄酮途径基因在整个果实的空间表达

为了确定是否存在空间调控和时间，在次年（2007年）木质素基因诱导高峰时间点（47 DAB）采集果实，并解剖成内果皮、中果皮、外果皮和种子。从每个组织中提取总RNA并用于qPCR。测试了4个代表性基因，以确定它们的表达是否具有组织特异性。

结果表明，全果是47 DAB诱导时间单一的3个PP基因（PAL和C3H）和7个木质素基因（CCoAOMT、POX和LACC）对果皮具有较大特异性，而木质素途径基因CCR和C4H以及类黄酮途径基因CHS、DFR、LDOX和F8H在87个果实组织中表达相似。

为了将观察到的木质素基因诱导水平置于其他木质化组织的背景下，我们还测试了PAL，C40H，CCoAOMT和POX在发育桃木中的表达。

我们收集了一个额外的水果发育系列，从木质素沉积开始之前开始，到木质素沉积最大结束。所有果实均被解剖成内果皮、中果皮和外果皮。2008年，木质化比10年和2006年晚了约2007天，可能是由于漫长的凉爽春季，但基于间苯三酚-HCl染色，果实处于相似的发育阶段。

对8个代表性基因（PAL，C4H，CCoOMT，POX，CCR，C3H，CHS和DFR）的所有切片组织和时间点进行了qPCR研究。PAL，CCoAOMT和POX显示内果皮中的表达显著增加，而中果皮或外果皮中的表达相对较少，证实了先前的数据。

我们不能排除在中果皮中观察到的小水平诱导是由于内果皮和中果皮的不精确解剖，它们具有有蹄类，不均匀的边界。C4H在内果皮中显示出明显的诱导，但在中果皮和外果皮层中也显着诱导，大约在1周前达到峰值。这一结果与2006年全国数据集中观察到的其他小峰一致。

与木质素途径基因不同，类黄酮基因CHS和DFR的表达主要在中果皮和外果皮中。诱导与PP和木质素途径基因大约同时开始，但在木质素沉积或木质素基因诱导之前，在内果皮中也观察到较小的峰。木质素通路基因CCR和C3H与CHS和DFR表现出重叠的表达模式，区别在于C3H在肉中没有实质性诱导，而CCR在内果皮中显示出49 DAB的轻微峰值。

由于C3H qPCR引物不是针对单个基因的特异性，因此我们不能排除单个C3H家族成员在这些组织中差异表达的可能性。值得注意的是，当木质素途径基因最高时，内果皮中的CHS和DFR表达最低。总的来说，这些数据表明，在3年的全国研究中观察到的类黄酮途径基因以及CCR和C2006H的周期性诱导模式可能是由于内果皮，中果皮和外果皮中的单独诱导事件。

果实木质素和类黄酮途径调节子的鉴定

鉴于不同但重叠的木质素和类黄酮基因表达模式的明显生理意义，我们接下来尝试使用经过验证的基因作为模板，通过Pavlidis模板匹配（PTM）从微阵列数据中鉴定相应的调节子。结果显示在附加文件9中。以PAL、CCoAOMT、POX和LACC形成的簇为模板，鉴定出290个基因（调节子1）（P值0.01），显示结石特异性表达模式。

当使用类黄酮基因CHS，DFR，F3H和LDOX时，208个基因表现出匹配的表达模式。这两个数据集重叠了18个基因，其中包括C4H。正如预期的那样，木质素途径基因主要存在于调节子1中，而类黄酮基因在调节子2中含量丰富。

对两种调节子中的基因进行仔细的手动分类表明，它们含有相似类别的基因，但有一些例外。Regulon 1富含细胞壁合成/修饰基因，包括纤维素合酶，植物螯合酶和多半乳糖尿酸酶。Regulon 1还包含许多编码糖酵解酶的基因，这些基因在调节因子2中不存在，而Regulon 2富含淀粉生物合成基因。

与其他水果表达研究的比较

随后，我们分析了现有苹果、番茄和胡椒果实表达谱研究的数据，以确定观察到的PP、木质素和类黄酮途径基因诱导是否具有物种特异性。类黄酮途径基因CHS、F3H、DFR和LDOX在苹果果实发育早期上调，但在辣椒或番茄中没有实质性诱导。相比之下，木质素途径不是在苹果或番茄果实发育过程中诱导的，而是在辣椒成熟过程中稳定诱导的。这与木质素途径在辣椒素生物合成中的明显作用一致。

内果皮木质化发生在多种被子植物中，包括干果和肉质果实。这意味着它要么是通过相对简单的进化变化发生的适应性过程，要么它代表了一种祖先状态，在这种情况下，具有非木质化内果皮的水果会间歇性地失去这种特征。为了解决这个问题，我们研究了已知控制裂开的拟南芥基因的桃子同系物的表达模式。

这表明桃石形成和拟南芥裂开的控制存在差异。我们发现SHP和STK都具有内果特异性，并且从分析的最早果实阶段（29 DAB）开始稳步下降，而内果皮中的FUL始终低于中果皮或外果皮。这些模式反映了拟南芥对应物的模式，并且与FUL作为SHP和STK负调节因子的推定作用一致。值得注意的是，随着SHP和STK的下降，内果皮中的FUL表达没有增加。

因此，SHP 和 STK 似乎不受内果皮中动态 FUL 水平的主动调节;相反，可能是FUL的相对比例使SHP和STK能够促进内果皮分化。令人惊讶的是，ALC和IND表达在组织类型或发育时间方面没有显著变化。然而，我们不能排除内果皮的特定作用，因为这些基因在果实发育中的作用可能比这里分析的要早得多。

桃子中的内果木质化与中果皮和外果皮组织层中竞争性类黄酮途径的单独诱导同时发生。类黄酮诱导似乎在蔷薇科物种中是保守的，也可能是许多其他肉质水果，而木质素途径诱导则不是。这两个过程的协调对于控制一些重要的水果和坚果农艺特性可能至关重要。此外，桃子和拟南芥内果皮的发育似乎都受到非常相似的机制控制，包括调节转录因子SHP和STK（促进内果皮分化），FUL（负调节因子）和NST1 / 3触发次生壁形成和木质素沉积。