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FSHW | NanoLC-Orbitrap质谱检测三种中国高油酸品种花生中的致敏蛋白

花匠小妙招
2025-01-17 19:40

Introduction

花生过敏是一种免疫球蛋白E（IgE）介导的食物过敏，其致敏阈值低，发病率逐年上升。高油酸花生因其保质期长、有较好的健康功效而被广泛食用。然而，高油酸花生的致敏性和致敏蛋白谱尚不清楚，存在潜在的食品安全风险，有待进一步研究。质谱具有灵敏度高、受基质干扰小、准确度高适等优点，当其与液相色谱串联使用时，可明确鉴别蛋白质。

中国农业大学食品科学与营养工程学院薛文通教授、贾鑫副教授在本文中以三种新品种高油酸花生为研究对象，使用NanoLC-Orbitrap质谱鉴定新品种高油酸花生中的过敏原蛋白并半定量其中的主要过敏原蛋白。根据致敏蛋白肽段特点制定特异性肽段筛选方法，得到了可用于检测Ara h 1和Ara h 3的三条特异性肽段。

Results and Discussion

3种新品种高油酸花生理化指标

花生中主要含有灰分、蛋白质、脂肪三种组成成分，每种花生的各成分含量见表1。三种中国高油酸花生的蛋白质含量约为22%。冀花13和冀花18脂肪含量相近，分别为49.94%和49.95%，冀花16脂肪含量略高于前两种，为54.75%。虽然高油酸品种花生的脂肪含量与常规品种花生无显著性差异，但其脂肪酸组成和含量与常规品种不同。

表1 3种高油酸花生主要组分及其含量（%，m/m）

表2是三个中国高油酸品种花生的脂肪酸组成。高油酸花生中油酸含量高达80.1%-81.2%，而传统花生品种中油酸含量通常约为41.3%-59.1%。冀花13、冀花16和冀花18的油酸/亚油酸（O/L）比分别为24.4:1, 20.5:1和24.7:1，与传统花生（O/L比约为1.5）相比，高油酸花生的高O/L比有助于延长保质期，改善风味，增加健康益处。

表2 3种高油酸花生的脂肪酸组成及其含量（%）

3种高油酸花生过敏原蛋白质谱检测结果

对提取的花生粗蛋白进行了基于高分辨质谱的蛋白质组学研究，得到三种高油酸花生的蛋白质和肽谱。总的来说，共检测出了37009个具有不同置信度的肽，其中有31954个高置信度（置信度大于5）的肽。在31954个高置信度肽中，一共有2191个肽段来自于59个过敏蛋白亚基中，剩余的29763个肽不属于致敏蛋白，或者来源于未能鉴别的蛋白质（来自916个亚基的9308个肽）。在选择的三个高油酸花生品种：冀花13、冀花16和冀花18中，分别鉴定出11、8和9个致敏蛋白。3种高油酸花生均含有Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 6、Ara h 8和Ara h 10，其中Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3和Ara h 6是高度致敏的过敏原蛋白。

表3是三种选定的高油酸花生中致敏蛋白的分布。在选择的3个中国高油酸花生中，Ara h 1和Ara h 3的含量与常规花生相比无显著差异。然而，Ara h 2含量均低于 0.4%（m/m），与传统品种花生相比要低一倍。

表3 3种高油酸花生样品中过敏原蛋白含量（%）

筛选用于过敏原蛋白鉴定的特异性肽段

根据特异性肽段所需具备的条件，制定了以下几个步骤用来筛选特异性肽段：1）基于UniProt数据库，肽段需出现在致敏原蛋白及其亚基中；2）肽段中无内源性修饰；3）保留肽谱匹配（PSMs）高于3的肽段；4）肽段只存在于某个或某两个亚基中；5）肽段长度为7-20个氨基酸；6）肽段中不含蛋氨酸和半胱氨酸。

图1 高油酸花生特异性肽段筛选流程及各步骤肽段数量图

通过上述筛选流程，对质谱获得的多肽数据进行过滤和分析，图1下半部分是每个筛选步骤后剩余的肽段数。冀花13中有来自22个亚基的597条肽段，冀花16中鉴定出了16个亚基和706条肽段，冀花18中鉴定出了16个亚基和888条肽段。随着筛选流程的进行，候选肽段数量随圆圈的减小而减小。最后，在冀花13、冀花16和冀花18中分别鉴定出64、68和83个潜在的特异性肽段，具体见表4。

表4 用于检测高油酸花生样品中过敏原的特异性肽段

图2显示的是同时出现在3中高油酸花生中的特异性肽段，这41条肽段分别来自于Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 8 和 Ara h 10，丰度在8.8～11之间。结合PSMs值和丰度值，分别来自Ara h 1和Ara h 3的IVQIEAKPNTLVLPK、SSNPDIYNPQAGSLR、AQSENEYEYLAFK丰度高、质谱响应性好，可用作检测其他基质中致敏蛋白的特异性标记肽段。

图2 3中高油酸品种花生中特异性肽段的相对丰度

Conclusion

本研究开发了一种稳健可行的基于Orbitrap Fusion的质谱检测方法和特异性肽段筛选方法，用于检测中国高油酸花生中的过敏蛋白。经检测发现，冀花13和冀花16的过敏原蛋白及其亚基具有相似性，而冀花18中的过敏原蛋白则有所不同。所有精选的高油酸花生均含有高致敏蛋白 Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3和Ara h 6。冀花13还含有Ara h 4、Ara h 7、Ara h 8、Ara h 9、Ara h 10、Ara h 15和Ara h 17。冀花16还包含Ara h 7、Ara h 8、Ara h 10和Ara h 15，而冀花18还包含Ara h 4、Ara h 8、Ara h 11、Ara h 14。中国高油酸花生品种的致敏蛋白谱与常规花生非常相似。在所研究的三种高油酸花生中，主要存在两种过敏原蛋白：Ara h 1和Ara h 3；Ara h 1约占总过敏原蛋白的17%～25%，Ara h 3占总过敏原的67%～70%，其余过敏原蛋白占比较少。

此外，本研究还开发了一种全面的特异性肽段筛选流程，用于鉴定花生过敏原蛋白中的特异性肽段。该筛选方法的可行性和可靠性也得到了有效验证。通过该方法，鉴定了三种新的特异性肽段IVQIEAKPNTLVLPK、SSNPDIYNPQAGSLR和AQSENEYEYLAFK可分别用于作为Ara h 1、Ara h 3和 Ara h 3的特异性肽段，且这三条肽段丰度高、质谱响应性好、准确性高，可作为候选肽标记物用于检测不同食品基质中的花生过敏原。

第一作者

杨炘珂，女，中国农业大学硕士研究生（在读）；主要研究方向为花生过敏蛋白检测与改性，参与国家重点研发项目的研究工作。以第一作者在Food Science and Human Wellness发表SCI论文一篇，申请国家发明专利1项。

通信作者

贾鑫副教授，中国农业大学食品科学与营养工程学院副教授，博士生导师，长期从事食物安全，食物过敏相关研究，主持国家自然基金青年项目一项，国家重点研发计划子课题一项，北京市自然科学基金一项，企业横向项目3项。在本领域高水平期刊发表学术论文20余篇，参编《食品原料学》等教材3部，担任MDPI Foods客座编辑。

薛文通教授，中国农业大学食品科学与营养工程学院教授，博士生导师，长期从事食物致敏原降敏机制研究，主持食物过敏国家相关自然科学基金项目6项，主持参与国家科技支撑计划项目、重点研发计划项目4项，国际合作项目2项，其他省部级研究项目19项，发表SCI/EI等学术论文210篇，出版《主要食物过敏原致敏机理的研究》等著作14部，授权国家发明专利8项。

Evaluation of allergenic protein profiles in three Chinese high-oleic acid peanut cultivars using NanoLC-Orbitrap mass spectrometry

Xinke Yanga, Haochen Baia, Lijun Yina, Jin Wangb, Wentong Xuea,*, Xin Jiaa,*

a College of Food Science and Nutritional Engineering, Beijing Key Laboratory of Functional Food from Plant Resources, China Agricultural University, Beijing 100083, China

b The Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Institute of Cereal and Oil Crops, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050035, China

*Corresponding author.

Abstract

High oleic-acid peanuts are known for their pre-longed shelf-life and health benefit due to high content of oleic fatty acid. However, the allergenicity and allergenic protein profiles in Chinese high-oleic peanuts have yet to be studied. For this purpose, an Orbitrap Fusion mass spectrometry (MS)-based method that is feasible for identification of putative allergenic protein as well as semi-quantitation of five major allergen protein in three different Chinese high-oleic peanut cultivars (JH 13, JH 16 and JH 18) have been reported. Results show that three Chinese high-oleic acid peanut cultivars selected all contained highly allergenic proteins Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 and Ara h 6. The allergenic protein profiles of Chinese high-oleic acid peanut cultivars were very similar to that of conventional peanuts, but the allergenic protein subunits varied greatly among high-oleic peanuts. Additionally, a comprehensive peptide-filtering pipeline had been developed for identification of potential peptide markers in peanut allergen proteins. Through the peptide-filtering pipeline, three novel peptide markers, IVQIEAKPNTLVLPK, SSNPDIYNPQAGSLR and AQSENYEYLAFK surrogate to Ara h 1, Ara h 3 with high abundance, good MS response and highly reliability were identified, which can be used as candidate peptide markers for the detection of peanut allergens in different food matrices.

Reference:

YANG X K, BAI H C, YIN L J, et al. Evaluation of allergenic protein profiles in three Chinese high-oleic acid peanut cultivars using NanoLC-Orbitrap mass spectrometry[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(3): 851-860. DOI:10.1016/j.fshw.2022.09.026.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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