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荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法.pdf

花匠小妙招
2025-01-24 03:07

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510803915.0 (22)申请日 2015.11.20 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人江苏省中国科学院植物研究所地址 210014 江苏省南京市玄武区中山门外前湖后村 1 号 (72)发明人刘晓静杜凤凤姚东瑞常雅军李乃伟王忠 (54) 发明名称荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法 (57) 摘要本发明涉及农业生物技术领域，具体公开了一种荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法。使用该组引物进行 PCR 扩增并检测获取其 SSR 指纹数据，根据该指纹数据和本发明所公开的数据进行比较，。

2、可以快速准确地鉴定该荷花品种是否为摄山丹叶。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页 CN 106755288 A 2017.05.31 CN 106755288 A 1/1 页 2 1.荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法，其特征在于：用荧光标记引物 SSRD01（正向引物序列 5-GACTAATGAAACAGGGGTTAGGGC-3，反向引物序列 5-TCTCCAATCTCCCAACGACTCTTA-3）对摄山丹叶叶片提取的 DNA 进行扩增，扩增产物通过毛细管电泳荧光检测，得到且只能得到该位。

3、点的片段大小为 148bp 和 164bp ；用荧光标记引物 SSRD02（正向引物序列 5-TAGACCAGGCTAGGATGGGGTAG-3，反向引物序列 5-AGTTAATGACATCTGCAGGGTGGT-3）对摄山丹叶叶片提取的 DNA 进行扩增，扩增产物通过毛细管电泳荧光检测，得到且只能得到该位点的片段大小为 233bp 和 249bp ；用荧光标记引物 SSRD03（正向引物序列 5-TTGGATTGAGTAAATGAGGGGAAA-3，反向引物序列 5-AGAAACTTCCTCAGGTTTCAAGCA-3）对摄山丹叶叶片提取的 DNA 进行扩增，。

4、扩增产物通过毛细管电泳荧光检测，得到且只能得到该位点的片段大小为 268bp 和 284bp。 2.根据权利要求 1 所述的荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法，其特征在于：同时用以上 3 对引物对荷花某一品种进行 SSR 荧光扩增，每对引物得到结果与上述要求的 SSR 指纹数据完全一致，则表明该品种为摄山丹叶。权利要求书 CN 106755288 A 2 1/4 页 3 荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法技术领域 0001 本发明涉及农业生物技术领域，具体的说，是基于基因组 SSR 标记的荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法。背景技术 0002 荷花（Nel。

5、umbo nucifera）也称莲花，是多年生挺水植物，我国十大传统名花中唯一的水生花卉；在我国已有两千多年的栽培历史，具有极高的观赏价值和深厚的文化底蕴。荷花的群体花期长，而且在整个生长期都有观赏价值 , 以其美观的形态、独特的清香而深受人们喜爱，为水景园林布置中的主题植物，是重要的夏季观赏花卉之一，也可用于插花和盆景。 0003 我国分布的野生荷花资源为中国莲，花色包括红色、粉色及白色，花型多样，除少瓣花型外，还有重瓣、重台、千瓣等；红色系荷花是广受消费者欢迎的、具极高观赏价值的品种，但是颜色鲜红至深紫红色的荷花品种亦不多见。江苏省中。

6、科院植物研究所与大学和企业联合攻关，培育了一个优异的红色系荷花新品种摄山丹叶。摄山丹叶花色为紫红色，绚丽夺目；植株高大挺拔，着花密度大，群体花期长，抗逆性佳、适应性广，广泛适应于长江中下游地区种植。该品种于 2015 年已经通过江苏省农委鉴定。 0004 摄山丹叶是典型的营养繁殖型荷花新品种，其外部形态特征易受到环境条件和管理水平的影响，导致消费者难以辨别品种的真实性，给新品种的开发利用带来影响。因此，寻找一种真实有效、不受环境影响，能够准确区分不同基因型的简单、有效的鉴别技术十分必要。 0005 SSR（简单重复序列）分子标记技术是以 P。

7、CR 为基础的 DNA 多态性检测技术，具有共显性、稳定性好、多态性高和遗传信息量大的特点，与其他的分子标记相比较有明显的优势，是理想的分子标记方法。发明内容 0006 技术问题：本发明提供一种基于荷花基因组 SSR 标记的荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法，克服了仅依据形态特征鉴定新品种的不确定性，且检测方法更为快速、准确、高效。 0007 技术方案：上述荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法，其特征在于： 1. 用 CTAB 法提取摄山丹叶幼嫩叶片的 DNA。 0008 用荧光标记引物 SSRD01（正向引物序列 5-GACTAATGAAACAGGGG。

8、TTAGGGC-3，反向引物序列 5-TCTCCAATCTCCCAACGACTCTTA-3）对上述 DNA 进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳荧光检测法检测分析，得到且只能得到该位点的片段大小为 148bp 和 164bp。 0009 用荧光标记引物 SSRD02（正向引物序列 5-TAGACCAGGCTAGGATGGGGTAG-3，反向引物序列 5-AGTTAATGACATCTGCAGGGTGGT-3）对上述 DNA 进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳说明书 CN 106755288 A 3 2/4 页 4 荧光检测法检测分析，得到且只能得到该位点的片段大小为 233。

9、bp 和 249bp。 0010 用荧光标记引物 SSRD03（正向引物序列 5-TTGGATTGAGTAAATGAGGGGAAA-3，反向引物序列 5-AGAAACTTCCTCAGGTTTCAAGCA-3）对上述 DNA 进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳荧光检测法检测分析，得到且只能得到该位点的片段大小为 268bp 和 284bp。 0011 同时用以上 3 对引物对荷花某一新品种叶片 DNA 进行 SSR 荧光扩增检测，每对引物得到结果与上述要求的 SSR 指纹数据完全一致，则表明该品种为摄山丹叶。否则为其它品种。 0012 2. 扩增及检测方法： SSR-PC。

10、R 采用 25ul 的反应体系，其中包括 50ng DNA, 2.5L 10PCR buffer, 0.2mmolL-1 dNTPs, 1U Taq DNA 聚合酶，正反向引物各 4molL-1； PCR 扩增程序为： 94预变性 5 min ； 94 变性 30 s， 55 C 60退火 30 s， 72 延伸 30 s， 35 个循环； 72 延伸10 min， 4保存；扩增产物用美国ABI3730 进行自动荧光检测，用GeneMapper软件分析原始数据，获得 SSR 指纹数据。 0013 有益效果： 1. 本发明通过直接检测摄山丹叶的 DNA 。

11、序列对其进行鉴定，克服了依据外部形态特征对其鉴定的不确定性； 2. 本发明为摄山丹叶新品种保护提供了科学的技术保障； 3. 本发明为摄山丹叶品种推广应用过程中的鉴定提供了实验证据。具体实施方式 0014 1. DNA 的提取及鉴定标记的获得选择生产上常用且具代表性的 27 种荷花品种，采集这 27 个品种以及摄山丹叶的幼嫩叶片，使用 CTAB 法提取其基因组 DNA。用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳和 OneDrop 分光光度计检测 DNA 质量和浓度。 0015 用 15 对 SSR 引物对所提取的 DNA 进行扩增。SSR-PCR 采用 25L 的反应体系，其。

12、中包括： 50ng DNA, 2.5L 10PCR buffer, 0.2mmolL-1 dNTPs, 1U Taq DNA 聚合酶，正反向引物各 4molL-1。SSR-PCR 扩增程序为： 94预变性 5 min ； 94 变性 30 s， 55 C 60退火 30 s， 72 延伸 30 s， 35 个循环； 72 延伸 10 min， 4保存。扩增产物用美国 ABI3730 进行自动荧光检测，用 GeneMapper 软件分析原始数据，获得各位点等位基因数据。 0016 扩增结果表明， 15 对引物中 SSRD01、 SSRD02 及 SSRD03 三对引物的 PI。

13、C 值最大，多态性最好（表 1），用这三对引物完全可以区分摄山丹叶与供试的其它 27 个品种，指纹数据见表 2。 0017 表 1 三对 SSR 引物多态性说明书 CN 106755288 A 4 3/4 页 5 表 2 28 个品种在 3 对 SSR 引物下的指纹数据品种名称引物 SSRD01引物 SSRD02引物 SSRD03 摄山丹叶148/164233/249268/284 金凤凰158/172233/249266/282 碧云164/172229/245266/282 粉青莲172229/245268/284 锦衣卫168/172229268/284 金太阳。

14、158/172233/245266/282 逸仙莲148/164237268/284 宜良千瓣158233/249266 红台莲158233/249266/282 伯里夫人148/172229266/282 艾江南148/168233266/282 大洒锦158/164233/249266/282 友谊牡丹莲164/172229/245268/284 中国红瑞金172/178233/245266/282 中国红井冈山158/164249266/282 中国红遵义158/164245268/284 中国红延安148/172229/245268/284 俊愉莲158233/249266/2。

15、82 精彩158245/249268/284 星甸红莲156/172245266/282 友谊莲164245268/286 粉精灵164/174249268/284 金陵畅想164/174229/233266/282 中国红西北坡164/172245266/282 中国红韶山158/172229/249268/284 红唇164233/245266/282 中国红嘉兴164/172233/245266/282 红纤指158249266/282 2. 用所筛选的 3 对 SSR 引物对摄山丹叶品种鉴定的验证实验用上述 3 对 SSR 荧光引物，选择江苏省中科院植物所和企业新选育的。

16、16 个荷花新品种，与摄山丹叶同时进行扩增，扩增及检测方法同上。结果发现，这 3 对引物可以将摄山丹叶与其它品种区分开，摄山丹叶与这 16 个品种的 SSR 指纹数据见表 3。 0018 表 3 17 个品种在 3 对 SSR 引物下的指纹数据品种引物 SSRD01引物 SSRD02引物 SSRD03 摄山丹叶148/164233/249268/284 说明书 CN 106755288 A 5 4/4 页 6 XY-N-1158/164245/249268/284 XY-N-2158/164229/245266/282 XY-N-3158203/215266/268 。

17、XY-N-4158/164215/245268/284 XY-N-5158/164229/249266/282 XY-N-6164245266/282 XY-N-7164/174229/249266/282 XY-N-8164/174229/245266/282 XY-N-9158229/245266/282 XY-N-10158233/249266/282 XY-N-11158/164229266/282 XY-N-12158/164229/245266/282 XY-N-13164245/249268/284 XY-N-14158/164233/249266/282 XY-N-15164233/245266/282 XY-N-16158/164237/245266/282 从验证结果可以看出，仅利用其中 1 对或 2 对 SSR 引物就可以区分摄山丹叶与其它 16 个新品种，但考虑到未来可能会有更多新品种出现，所以为了鉴定的科学性，本发明建议采用以上3对引物同时进行检测，若3对引物扩增得到的结果与本发明公布的完全一致，则说明该品种为荷花品种摄山丹叶。说明书 CN 106755288 A 6 。