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一种利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-10 08:45

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610225162.4 (22)申请日 2016.04.12 (71)申请人中国农业科学院蔬菜花卉研究所地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人王立浩张宝玺张正海毛胜利曹亚从 (74)专利代理机构北京法思腾知识产权代理有限公司 11318 代理人高宇 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称一种利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交。

2、系的方法 (57)摘要本发明涉及育种领域，具体涉及一种利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法。根据本发明的育种方法， PI152225与200316进行边分离、边回交转育，并采用分子标记辅助选择L3基因的方法。材料经过了5代回交和3代的自交，获得纯和自交系0516。经过鉴定0516抗TMV。权利要求书1页说明书4页序列表1页附图2页 CN 105724243 A 2016.07.06 CN 105724243 A 1.一种利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1)种间。

3、杂交：以PI152225为母本， Solanrio为父本进行杂交，经过浸种、发芽，获得了 F1代植株； (2)分子标记辅助选择，提取回交1代之后的分离群体单株的DNA，利用CAP分子标记进行选择，其中所用引物为： F:5 -GTGCCAGAGGAGGATTTAT； R:5 -GCGAGGTGGACACTGATACT； (3)结合生长性状选择筛选材料，根据抗病性筛选材料，抗病性筛选标准为： TMV抗性 8.9； CMV抗性29.5，疫病43.9； (4)回交：利用步骤筛选的材料为回交亲本进行回交，回交后代中利用CAPS分子标记进行选择，园艺性状的选择，经过5代回交。

4、，和3代自交获得纯和自交系。权利要求书 1/1 页 2 CN 105724243 A 2 一种利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法技术领域 0001 本发明涉及育种领域，具体涉及一种利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法。背景技术 0002 我国是世界上甜、辣椒(Capsicum annuum L)种植和消费量最多的国家。自上世纪 80年代，市场需求和种植面积不断扩大，播种面积由80年代末400万亩增加到如今3000万亩 (王立浩等， 2016)。 0003 病毒病是甜、辣椒生产中最主要的病害，可造成减产30-。

5、70或绝收，同时严重降低产品品质。 0004 烟草花叶病毒TMV在露地和保护地(特别是保护地)均有发生，原来的抗病品种(含 L1、 L2基因)表现为不抗，被病害所克服。 L3报道抗TMV P(0,1,2),L4基因抗TMV P(0,1,2, 3)，能够对抗TMV、 ToMV、 PMMoV。目前保护地辣椒生产中烟草花叶病毒属的TMV、 ToMV、 PMMoV 对于生产造成了很大威胁。保护地长季节生产面积增加较快，但我国传统的辣椒资源的抗病性不强，限制了保护地品种的选育；因此一度长季节保护地所用品种几乎全部为国外品种，培育具有国内品种成为我国蔬菜育种工作者的迫切任务。发。

6、明内容 0005 本发明的目的建立一种高效的辣椒育种方法，将L3基因的抗烟草花叶病毒病性导入到配合力高，大果，优良自交系0516中。 0006 本发明利用200374:PI152225是属于中国辣椒(C.Chinense)， 2003年法国农业科学院Alain Palloix博士提供，群体整齐，分枝性强，果实小(1.6cm4.0cm)。在我国北方结果性差，同一年生辣椒杂交亲和性低，含有L3基因，高抗TMV，作为抗TMV抗原材料。 200316: SOLARIO， 2003年从法国引进的甜椒F1品种。果实大，灯笼形，中抗CMV和疫病。 0007 根据本发明的育种。

7、方法， PI152225与200316进行边分离、边回交转育，并采用分子标记辅助选择L3基因的方法。材料经过了5代回交和3代的自交，获得纯和自交系0516。经过鉴定0516抗TMV。自交系0516，生长势中，叶大、叶量大，叶色深绿。茎有细绒毛，中晚熟，始花节位9.7，平均单果重200克，果实纵径11.1厘米，横径9.9厘米， 3-4心室，果实绿略浅，果面光滑、有光泽。 2005年经人工接种鉴定，抗病性： TMV抗性8.9； CMV抗性29.5，疫病43.9。 6个组合产量情况，其中折合亩产产量最高的组合是0516、 KLS。 6份材料的产量。

8、一般配合最高的是 0516，分别是222.4。 0008 根据本发明的利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法包括以下步骤： 0009 (1)种间杂交：以PI152225为母本， Solanrio为父本进行杂交，经过浸种、发芽，获得了F1代植株；说明书 1/4 页 3 CN 105724243 A 3 0010 (2)分子标记辅助选择，提取回交1代之后的分离群体单株的DNA，利用CAP分子标记进行选择，其中所用引物为： F:5 -GTGCCAGAGGAGGATTTAT； R:5 -GCGAGGTGGACACTGATACT； 0011 (3)结合。

9、生长性状选择筛选材料，根据抗病性筛选材料，抗病性筛选标准为： TMV抗性8.9； CMV抗性29.5，疫病43.9； 0012 (4)回交：利用步骤筛选的材料为回交亲本进行回交，回交后代中利用CAPS分子标记进行选择，园艺性状的选择，经过5代回交，和3代自交获得材料 0013 选择系谱见图3。图1显示了BC1代不同单株的L3分子标记的多态情况。材料经过了 5代回交和3代的自交，获得纯和自交系0516。 0014 根据本发明的具体实施方式，所述利用种间杂交和分子标记辅助选择引入L3基因选育甜椒自交系的方法包括步骤： 0015 (1)种间杂交：自2003年开始，利。

10、用两份材料进行了种间杂交，以PI152225(美国农业部种子资源库编号)为母本， Solanrio(商业品种)为父本进行杂交。杂交亲和力低，产籽率低，仅获得少数几粒饱满种子。经过正常的浸种、发芽，获得了F1代植株。 0016 (2)基因组DNA的提取与检测 0017 提取回交1代之后的分离群体单株的DNA，用于检测供筛选分子标记的多态性。 0018 (3)分子标记辅助选择：建立了种间杂交和分子标记辅助选择的育种技术体系： CAPS标记：引物： F:5 -GTGCCAGAGGAGGATTTAT； R:5 -GCGAGGTGGACACTGATACT；反应体系： DNA10。

11、0ng，引物0.25 mmolL-1。 PCR： 943min,94变性30s， 6030s， 7230s， 35循环， 72 5min， 4保存。分子量568bp,共显性标记， XbaI,TaqI,或HaeIII三种酶中任意一种酶切。 PCR产物的检测：取3 l PCR产物用8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。 0019 (4)回交：利用0516为回交亲本进行回交，回交后代中利用CAPS分子标记进行选择，园艺性状的选择。经过5代回交，和3代自交获得材料13P65，即0516。 0020 经人工接种鉴定，抗病性： TMV抗性8.9； CMV抗性29.5，疫病43.9。 00。

12、21 本发明的优点是1)种间材料获得抗源(L3基因在一年生辣椒中没有发现)； 2)利用分子标记准确在回交中辅助选择，提高了育种效率。附图说明 0022 图1 BC1代群体中单株的标记分离情况， 1-24：不同单株 0023 图2显示抗病性人工接种21天后的植株发病情况1： 0516， 2：对照品种 “茄门” 。 0024 图3系谱图。具体实施方式 0025 实施例1 0026 (1)种间杂交：自2003年开始，利用两份材料进行了种间杂交，以PI152225为母本， Solanrio F6(-0-14-17-1-3)为父本进行杂交。杂交亲和力低，产籽率低，仅获得少数几粒。

13、饱满种子。经过正常的浸种、发芽，获得了F1代植株。 0027 (2)基因组DNA的提取与检测 0028 提取回交1代之后的分离群体单株的DNA，用于检测供筛选分子标记的多态性。 0029 (3)分子标记辅助选择：建立了种间杂交和分子标记辅助选择的育种技术体系：说明书 2/4 页 4 CN 105724243 A 4 CAPS标记：引物： F:5 -GTGCCAGAGGAGGATTTAT； R:5 -GCGAGGTGGACACTGATACT；。分子量 568bp,共显性标记， XbaI,TaqI,或HaeIII三种酶中任意一种酶切。 PCR产物的检测：取3 l PCR产物。

14、用8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。 0030 (4)回交：利用0516为回交亲本进行回交，回交后代中利用CAPS分子标记进行选择，园艺性状的选择(选择标准是：果实大、座果多、抗病性强)。经过5代回交，和3代自交获得材料0516。 0031 2006年自交系利用TMV病毒(重花叶株系)进行接种鉴定。 TMV病毒采用普遍流行株系。鉴定方法参考Tomita等(2008)。每个材料接种30株，接种21天后进行调查。 0032 经人工接种鉴定，抗病性： TMV抗性8.9； CMV抗性29.5，疫病43.9。抗病性人工接种 21天后的植株发病情况1： 0516， 2：对。

15、照品种 “茄门” (图2)。 0033 配合力分析： 0034 选取6个自交系AF5； 0516； CL1421； RQN； KLS； 0601M；双列杂交配置组合。进行小区产量测定，三次重复。 0035 表1列出了所有组合产量情况，其中折合亩产产量最高的组合是0516、 KLS。 6份材料的产量一般配合最高的是0516，分别是222.4。 0036 表1不完全双列杂交组合的平均折合亩产情况(2010年) 0037 0038 AAF5； B0516； CCL1421； DRQN； EKLS； F0601M； 0039 表2 6份材料产量一般配合力表现(GCA) 说明书 3/4 页 5 CN 105724243 A 5 0040 0041 表1、表2看出，甜椒自交系0516在参比的6个自交系中的产量一般配合力最高，表明这是一个优良的亲本自交系，可以在杂交配组中采用。考虑聚合其他抗病性，进一步提高该自交系的配合力。对于选育品种，特殊配合力具有更直接的作用。说明书 4/4 页 6 CN 105724243 A 6 0001 序列表 1/1 页 7 CN 105724243 A 7 图1 图2 说明书附图 1/2 页 8 CN 105724243 A 8 图3 说明书附图 2/2 页 9 CN 105724243 A 9 。