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【推荐下载】HPLC法测定扶桑花中槲皮素的含量测定方法

花匠小妙招
2025-01-28 09:14

HPLC法测定扶桑花中槲皮素的含量测定方法
【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的论说性文章。

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HPLC法测定扶桑花中槲皮素的含量测定方法
【摘要】目的建立扶桑花中槲皮素的含量测定方法。

方法采用HPLC法，色谱柱为Dikma platisil ODS柱(250 mm 4.6 mm, 5 m)，流动相为甲醇?0.5%磷酸水溶液(体积比30∶70)，流速1.0 mL min-1，柱温30 ℃，检测波长360 nm。

结果槲皮素进样量在0.041 6～0.416 g范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为98.95%，RSD 为1.09%(n=6)。

结论该方法操作简便、快速、准确，可用于扶桑花药材的质量控制。

【关键词】扶桑花;槲皮素;高效液相色谱法
Abstract:Objective To develop a method for the determination of quercetin in Flos Hibisci Rosae?sinensis. Methods HPLC was performed using a Dikma platisil ODS column (250 mm
4.6 mm, 5 m) with methanol?0.5% phosphoric acid solution (30∶70) as mobile phase under
a flow rate of 1.0 mL min-1. The column temperature was 30 ℃,and the detection wavelength was 360 nm.Results The calibration curve of quercein was linear within the range of 0.041 6-0.416 g, and the average recovery was 98.95% with the RSD of 1.09% (n=6). Conclusion This method is convenient, reproducible and accurate, and can be used in quality control of Flos H. Rosae?sinensis.
Key words:Flos Hibisci Rosae?sinensis; quercetin; HPLC
扶桑花(Flos Hibisci Rosae?sinensis)为锦葵科植物朱槿(Hibiscus rosa?sinensis L.)的花，原产于我国，现广泛栽培于热带、亚热带地区，是我国及印度、斯里兰卡等国家和地区常用的民间药。

据本草记载，扶桑花主治肺热咳嗽、咯血、鼻衄、崩漏、白带、痢疾、赤白浊、痈肿毒疮等症[1]。

近年来，印度、巴基斯坦等国家对扶桑花抗生育(抑制排卵和着床、抑制精子生成)、抗肿瘤、抗痉挛、促生发、保护心脏、降血压、降血糖、降血脂[2～5]等活性进行了广泛研究，揭示了扶桑花极其重要的开发价值。

我国对扶桑花的药学研究和临床应用较少，其丰富的资源亟需开发。

目前，我国扶桑花仅有地方质量标准，且仅对药材的基源和性状进行鉴别[6]，尚无药效成分含量测定等方面鉴别的报道。

扶桑花含有多种黄酮类化合物[1]，其中，槲皮素及其糖苷具有抗氧化、抗肿瘤、抗流感、抗衰老、抗血栓、降血压、护心等作用
[7]，是扶桑花的主要药效成分之一，主要以槲皮素?3?二葡萄糖甙、槲皮素?3，7?二葡萄糖甙等形式存在[1]。

槲皮素的含量测定主要采用高效液相色谱法，但因槲皮素的存在形式不同而测定的色谱条件各异[8,9]。

本文对扶桑花中槲皮素的提取及HPLC测定方法进行分析，为完善扶桑花药材质量标准、扩大其临床应用奠定基础。

1 仪器与试药
仪器：上海天美LC2000型高效液相色谱系统(LC2030紫外检测器、T2000P色谱工作站);德国赛多利斯BP211D精密电子天平。

试药：槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号100081?200406，供含量测定用)。

扶桑花采自广州、中山、惠州等地，经广东药学院中药鉴定学教研室刘基柱老师鉴定为锦葵科木槿属植物扶桑的花。

样品批次见表1，色谱条件分析采用批次2。

提取用试剂均为分析纯，色谱分析用甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水。

表1 扶桑花样品批次
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Dikma platisil ODS色谱柱(250 mm 4.6 mm，5 m)，流动相为甲醇?0.5%磷酸水溶液(体积比30∶70)，流速1.0 mL min-1，检测波长360 nm，柱温30 ℃，进样量20 L。

理论板数按槲皮素计算大于5 000，分离度大于1.5。

色谱图见图1。

2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成104 g mL-1的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备将扶桑花药材阴干，粉碎，过3号筛，取粉末约1 g，精密称定，加甲醇50 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加20%盐酸15 mL溶解，加热回流1 h，迅速冷却，用石油醚萃取3次，每次15 mL，合并水相，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀，用0.45 m微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

图1 对照品(A)和供试品(B)的高效液相色谱图
Figure 1 HPLC chromatograms of standard (A) and sample (B)2.3 线性关系考察分别精密吸取标准品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

精密吸取20 L，按 2.1 项下条件进样。

以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(
g)为横坐标(X)绘制标准曲线，得回归方程：Y=40969 X-1090.3，r=0.999 8。

结果表明，槲皮素进样量在0.041 6～0.416 g范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验精密吸取对照品溶液20 L，连续进样5次，结果槲皮素峰面积的RSD为0.86%，表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性试验精密吸取供试品溶液20 L，分别于0、2、4、6、8、12 h进样分析。

结果槲皮素峰面积的RSD为1.58%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验精密称取同一批样品，按 2.2.2 项下方法平行制备供试品溶液5份，测定槲皮素含量，求得RSD为1.29%，重复性良好。

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蒺藜总皂苷口腔崩解片的制备工艺
作者：梁国成，吕洁，卢晓慧，周毅生
【摘要】目的筛选蒺藜总皂苷口腔崩解片的处方和制备工艺。

方法采用L9(34)正交试验法，以崩解时限为指标，以微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联乙烯吡咯烷酮、甘露醇等为辅料，筛选最佳处方和制备工艺。

结果优化后蒺藜总皂苷口腔崩解片崩解时间短，崩解时间为25 s左右，口感良好。

结论蒺藜总皂苷口腔崩解片达到设计要求，制法简便，崩解时间短，口感良好，服用方便。

【关键词】蒺藜总皂苷;口腔崩解片;正交试验
Abstract:Objective To screen on the formulation and preparation process of orally disintegrating tablets of saponins from T. terrestris L. Methods The L9(34)orthogonal was designed with disintegrating time as the assessment index, and MCC,L?HPC, PVPP, Mannitol et al were used in the formulation and preparation.Results The optimum preparation showed a short disintegration time of about 25 seconds with a good taste.Conclusion Orally disintegrating tablets of saponins from T. terrestris L. were achieved, which had a very short disintegration time with a good taste and was easy to be prepared.
Key words:Tribulus terrestris L.; saponin; orally disintegrating tablet; orthogonal
口腔崩解片是国外20世纪90年代开发的一种新剂型，具有不需用水送服、无需咀嚼，在口腔内能迅速崩解或溶解等优点，对于吞咽困难和用药自主性差的儿童和老年患者是一种理想的口服给药剂型[1]。

蒺藜为蒺藜科植物(Zugophyllaceae)蒺藜(Tribulus terrestris L.)的干燥成熟果实。

现代研究证明，蒺藜中含有皂苷、黄酮、生物碱、多糖等多种化学成分，其中甾体皂苷类成分为主要有效成分。

蒺藜的药理作用主要有对心血管系统的作用，强壮与抗衰老作用，激素样作用[2]。

国内以蒺藜的提取物蒺藜总皂苷为原料制成的制剂心脑舒通目前已投放市场，用于治疗心脑血管疾病，疗效较好。

但目前以蒺藜总皂苷为原料的速释剂型尚未见报道，本文以崩解时限为指标，研究蒺藜总皂苷口腔崩解片的处方和制备工艺。

1 仪器与材料
GZX?9240MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);DHG?9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海医用恒温设备厂);AY?120电子天平称(日本岛津公司);钢丝筛网(上虞市五四仪器筛具厂);DP单冲压片机(上海天凡药机制造厂);78X?2型片剂四用测定仪(上海黄海药检仪器厂)。

蒺藜总皂苷(自制，含总皂苷57%);微晶纤维素(MCC，浙江湖州展望化学药业有限公司);低取代羟丙基纤维素(L?HPC，浙江湖州展望化学药业有限公司);交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP，上海昌为医药辅料技术有限公司);聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30，上海伯奥生物技术科技有限公司);甘露醇(浙江湖州展望化学药业有限公司);硬脂酸镁(温州市化学用料厂);95%乙醇(分析纯，天津市富宁精细化工有限公司)。

所用药用辅料质量均符合《中国药典》2005年版二部规定。

2 方法与结果
2.1 崩解剂的筛选
处方中对剂型的崩解时限影响主要为崩解剂，据文献报道[3]，MCC与L?HPC联用效果较好，故一并进行考察。

参考文献[4]，用脱脂棉蘸取少量硬脂酸镁涂抹冲模表面，分别以微晶纤维素(MCC)、低取代羟丙基纤维素(L?HPC)、MCC∶PVPP(4∶1)、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、羧甲基纤维素钠(CMC?Na)、交联羧甲基纤维素钠(CCNa)，直接压制成260 mg的片剂，压片压力保持一致。

广东药学院学报第26卷第1期梁国成,等.蒺藜总皂苷口腔崩解片的制备吸水膨胀性的具体测定方法为：培养皿(直径6.5 cm)中铺一层脱脂棉，用足量的水将其浸湿，并在整个实验过程中始终使其保持充分浸湿状态。

用钢丝筛网自制一圆形小筐，筐内铺一层滤纸，然后放在脱脂棉上，待纸被充分润湿后称质量。

片剂放入小筐中央，小筐
放在脱脂棉上。

经1、3、5、10、12 min后，取出小筐称质量，即可得片剂在一定时间间隔后的吸水量(g)。

以吸水速度快、膨胀率大者为佳。

根据实验结果，选用MCC、L?HPC、PVPP作为崩解剂。

2.2 不同MCC与L?HPC配比对片剂崩解时间的影响
根据 2.1 试验结果，采用MCC、L?HPC、PVPP作为崩解剂，分别以不同比例，和10.5%的蒺藜总皂苷一起压制成片。

处方(单片剂量，mg)：蒺藜总皂苷27.3，PVPP 18.2，MCC、L?HPC，甘露醇150.8，硬脂酸镁1.3。

固定处方其他辅料不变，仅改变MCC和L?HPC两者比例，考察两者对片剂崩解时间的影响。

结果表明各处方间存在差异(见表1)，其中以4号试验结果较好，即MCC与L?HPC 的质量比为4∶1时崩解较好。

2.3 处方的筛选
采用湿法制粒技术进行压片，所用黏合剂对片剂崩解性能有较大影响。

聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)易溶于水与乙醇，其乙醇溶液作为口腔崩解片湿法制粒的黏合剂，制得的片剂遇水易润湿，对片剂崩解的不利影响相对较小。

故将PVP的乙醇溶液作黏合剂，以减少水分带入。

选取MCC和L?HPC(4∶1)混合物的用量(A)、PVPP的用量
(B)、PVP的乙醇溶液浓度(C)、溶解PVP所用乙醇浓度(D)为考察因素,以L9(34)正交试验法进行优化，结果见表2-表4。

表1 不同比例MCC和L?HPC对崩解时间的影响表2 因素水平表表3 L9(34)正交实验结果表4 方差分析表
由以上正交试验可知，影响因素主次为B C A，其中B影响显著，最佳组合为A2B1C2D3，即处方中MCC+L?HPC为25%，PVPP为5%，PVP为4%的乙醇液，PVP以95%的乙醇液溶解。

2.4 润滑剂的选择
本制剂采用湿法制粒，为改善颗粒的流动性与填充性，需加入润滑剂。

对比加与不加润滑剂，以及加入滑石粉、硬脂酸镁的不同量，经过试验比较，加入0.5%的硬脂酸镁的效果最好，故选用0.5%的硬脂酸镁作为剂型的润滑剂。

2.5 矫味剂的选择
口腔崩解片因在人体口腔中崩解，要求口感要好，无砂砾感，对口腔粘膜无刺激性，容易吞咽。

因蒺藜总皂苷味苦，直接服用顺应性较差，故需添加适量的矫味剂，改善口感。

水果香精气芳香，能够刺激钝化味蕾，有效的掩盖药物的不良味道。

口感测定方法：取不同比例的片剂，分别放入6名健康志愿者口腔中，实验前志愿者用清水漱口3次，通过甜味、清凉感、芳香味、苦味、砂砾感等味觉作为考察指标。

分别比较加入水果香精0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%时的口感，确定最佳加入量，见表5。

表5 口感测试结果
Table 5 Results of the tastes
处方号ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ水果香精/%0.20.40.60.81.01.2口感无甜味，无香精气味，无清凉感，味苦、无砂砾感无甜味，无香精气味，无清凉感，味苦、无砂砾感味微甜，微有香精气味，无清凉感，味苦、无砂砾感味微甜，微有香精味，微有清凉感，味微苦、无砂砾感味甜，有香精气味，有清凉感，无苦味、无砂砾感甜味，香精气味浓，清凉感，无味苦、无砂砾感
通过比较得知，香精比例增加，片剂气味有较大改善，6位志愿者均感处方Ⅴ甜味、清凉感、果香气味适中，处方Ⅵ香精味过浓烈，故选用处方Ⅴ为佳，即采用1.0%比例的水果香精。

2.6 处方工艺验证及片剂制备方法
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2.7 加样回收率试验取扶桑花粉末约0.25 g，精密称定，分别加入一定量的槲皮素对照品，按 2.2.2 项下方法处理并测定槲皮素含量，平均回收率为98.95%，RSD为1.09%，见表2。

2.8 样品测定取不同批次的样品，按 2.2.2 项下方法提取槲皮素，精密吸取供试品溶液20 L，注入高效液相色谱仪，记录槲皮素的峰面积，采用外标法计算含量。

结果见表3。

表2 加样回收率试验结果表3 扶桑花中槲皮素的含量测定(n=3)
3 讨论
3.1 本实验曾考察了不同质量分数(10%、20%、30%)的盐酸，在不同温度(80、90、100 ℃)下，水解不同的时间(0.5、1、1.5 h)的效果，结果表明用20%的盐酸，于90 ℃水解1 h，所得槲皮素提取率最高。

3.2 色谱条件考察了甲醇?水、甲醇?0.1%磷酸水溶液、甲醇?0.5%磷酸水溶液等流动相的分离效果，发现流动相中加入磷酸可提高分离度，改善峰形、避免拖尾，以甲醇?0.5%磷酸水溶液为流动相时分离效果最好。

3.3 本文建立的HPLC测定扶桑花槲皮素含量的方法具有简便、高效、重复性高等特点，可用于扶桑花药材的质量控制。

【参考文献】
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中药本草(第五册)[M].上海:上海科学技术出版社,1999: 351-352.
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[3]DELA F,Hibiscus H.Tradition and modernity[J]. Phytotherapie, 2006, 4(3): 136-144.
[4] GILANI A H, BASHIR S, JANBAZ K H, et al.Presence of cholinergic and calcium channel blocking activities explains the traditional use of Hibiscus rosasinensis in constipation and diarrhea[J].J Ethnopharmacolo,2005,102(2):289-294.
[5] VENKATESH S,THILAGAVATHI J,SHYAM S D.Anti?diabetic activity of flowers of Hibiscus rosasinensis[J]. Fitoterapia,2008, 79(2):79-81.
[6] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准[M].南宁:广西科学技术出版社, 1992:57,212-214.
[7] DAVIS J M, MURPHY E A, CARMICHAEL M D.Effects of the dietary flavonoid quercetin upon performance and health[J].Curr Sports Med Rep, 2009, 8(4):206-213.
[8] 李萍.高效液相色谱法测定黄毛儿草中槲皮素的含量[J].广东药学院学报, 2006, 22(1): 57-58.
[9] 孙也之,王琳,刘振,等.高效液相色谱法测定白花蛇舌草中槲皮素的含量[J].广东药学院学报,2007,23(1): 5-6
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