PtrDFR基因的克隆与其在毛白杨中功能鉴定研究
论文摘要
花青素具有抗氧化、改善血液循环、治疗糖尿病性视网膜病、消肿化淤和抑制静脉曲张等功能。由花青素生成的花色苷具有多种生态功能,包括光保护作用、提高植物耐寒抗冻能力、提高植物的抗旱及渗透应激能力、清除自由基、抗氧化作用和抗病虫害作用。原花青素具有抗脂质过氧化和清除自由基、降血压、降血脂、消炎、抗肿瘤、预防心血管疾病以及抗辐射、抗衰老、抗疲劳等功效。花青素和原花色素的合成受到黄酮类化合物生物合成途径中重要关键酶即二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）的调控,其在草本植物拟南芥当中研究得较为清楚,但是在木本植物中还有待进一步论证。本研究根据黑杨（Populus trichocarpa）的PtrDFR1和PtrDFR2基因分析发现PtrDFR1和PtrDFR2基因都存在2个内含子和5个外显子,基于同源克隆,选择保守区域设计用于扩增毛白杨（Populus tomentosa Carr）DFR基因的引物：PtrDFR1-F、PtrDFR1-R和PtrDFR2-F、PtrDFR2-R。提取毛白杨叶片总RNA,反转录合成cDNA第一链,进行PCR扩增得到两个基因,分别命名为PtrDFR1和PtrDFR2。PtrDFR1包括一个1041 bp的ORF,编码346个氨基酸,其蛋白大小约为38.7 kDa;PtrDFR2存在一个1131 bp的ORF,编码376个氨基酸,其蛋白大小约为41.9 kDa。PtrDFR1氨基酸序列与美洲山杨、陆地棉、山葡萄、苹果、拟南芥和茸毛烟草的DFR氨基酸序列相似度高达97%、80%、79%、77%、73%和70%。PtrDFR2与黑杨、美洲山杨、陆地棉、葡萄、苹果、拟南芥和烟草的DFR氨基酸序列相似度高达84%、83%、83%、81%、78%、74%和70%。以葡萄的DFR为模型,得到Pt DFR1和Pt DFR2的三维构象,包括NADP结合位点和决定底物特异性的Thr、Lys和Tyr氨基酸残基。PtrDFR进化树分析显示毛白杨DFR与黑杨和美洲白杨为同科同属能聚为一簇。通过实时定量PCR分析表明,PtrDFR1和PtrDFR2在毛白杨各组织器官中均有表达,且在根中的表达量最高。通过RT-PCR分析PtrDFR1和PtrDFR2基因在毛白杨根、茎、叶、老叶、幼叶柄和老叶柄中的表达,半定量PCR结果表明PtrDFR1和PtrDFR2基因相对于其它组织而言,在叶中的表达量最高,与实时定量PCR结果一致。将PtrDFR1和PtrDFR2构建到原核表达载体pXSN和pET-22b,分别转入到大肠杆菌JM109和BL21中,结果皆没有检测到与理论相当的蛋白表达,原核表达的工作正在进一步改进中。将PtrDFR1和PtrDFR2构建到植物表达载体pBI121,形成正义表达载体pBI121-PtrDFR1-S和pBI121-PtrDFR2-S；同时构建反义植物表达载体pBI121-PtrDFR-As。通过根癌农杆菌LBA4404介导转化毛白杨并得到正、反义转基因植株。通过实时定量PCR分析表明正义PtrDFR1和PtrDFR2的表达量比野生型毛白杨要高,PtrDFR1基因的表达量比PtrDFR2较高。另外,转基因毛白杨花青素及原花色素含量定性分析表明PtrDFR1超量表达引起毛白杨花青素及原花色素含量的提高,正义PtrDFR2对毛白杨花青素及原花色素含量的影响不显著,对原花色素含量有较小的提高。
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摘要Abstract第1章 文献综述1.1 杨树的生物学特性1.1.1 杨树的形态特征及分布1.1.2 杨树的繁殖1.1.3 杨树的分类1.2 杨树的价值1.2.1 杨树的木材价值1.2.2 杨树的营养价值1.2.3 杨树的药用价值1.3 植物黄酮类化合物的研究进展1.3.1 黄酮类化合物结构及分类1.3.2 黄酮类化合物的生物合成途径1.3.3 黄酮类化合物生物合成途径的关键酶1.3.4 二氢黄酮醇4-还原酶基因的研究进展1.4 杨树转基因工程进展1.4.1 杨树遗传转化的方法1.4.2 杨树遗传转化的成果第2章 绪论2.1 研究的目的和意义2.2 研究的内容与目标2.2.1 研究内容2.2.2 研究目标2.3 技术路线第3章 实验材料与方法3.1 实验材料3.1.1 植物材料3.1.2 载体及菌株3.2 实验器材3.2.1 实验仪器3.2.2 购买试剂3.2.3 自配试剂3.2.4 引物合成及测序3.3 方法与步骤3.3.1 毛白杨DFR基因的引物设计3.3.2 毛白杨DFR基因的克隆第4章 研究结果与分析4.1 毛白杨DFR基因的引物设计4.1.1 杨树DFR基因的序列结构4.1.2 杨树DFR基因的同源性比较4.2 毛白杨DFR基因的克隆4.2.1 毛白杨RNA的提取4.2.2 毛白杨DFR基因的序列分析4.3 毛白杨DFR基因组织表达分析4.3.1 毛白杨RNA的提取4.3.2 毛白杨DFR基因组织表达特性异分析4.4 毛白杨DFR基因在大肠杆菌的表达4.5 毛白杨中的功能鉴定4.5.1 毛白杨的遗传转化4.5.2 转基因毛白杨的PCR鉴定4.5.3 转基因毛白杨DFR基因转录水平分析4.5.4 转基因毛白杨花青素及原花色素含量的测定第5章 讨论第6章 结论参考文献附录致谢在学期间发表的文章相关论文文献
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