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一种从葛花中直接提取鸢尾苷元的方法与流程

花匠小妙招
2025-02-19 09:18

本发明涉及植物药用成分提取技术领域，具体的说是涉及一种从葛花中直接提取鸢尾苷元的方法。

背景技术：

异黄酮(isoflavoen)是一类植物雌激素(phytoestrongen)，具有类雌激素样或抗雌激素作用，被称为天然的选择性雌激素受体调节剂，对人体健康起重要的保护作用。异黄酮类药物毒副作用小，安全可靠，具有多种生物活性，应用前景广泛。然而，异黄酮的分离纯化工序烦琐，耗时费力，且常常需要多种有毒的有机溶剂，不仅提高了药品的造价，而且给环境带来或多或少的污染，在一定程度上限制了异黄酮类药物的开发和应用。

异黄酮类化合物广泛分布于植物界，但异黄酮的含量却很低。鸢尾苷元作为异黄酮的一种，从葛花中提取的鸢尾苷的活性成份为其苷元，含有一个甲氧基和三个羟基的异黄酮，具有强抗氧化活性。葛花在我国自然资源十分丰富，从葛花中提取异黄酮有效成分用于新药研制，是有效利用自然资源的一项有力措施。

本发明公开一种鸢尾苷元制备新工艺，从葛花中直接获取鸢尾苷元，不经鸢尾苷的提取步骤，对于使葛花中异黄酮活性的增加具有深远的影响。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种从葛花中直接提取鸢尾苷元的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种从葛花中直接提取鸢尾苷元的方法，包括以下步骤：

步骤一、将葛花粉碎过60目筛，称取葛花粉末加入到浓度为0.1-2.0mol/l的盐酸溶液，即hcl的水溶液中，然后置于恒温水浴锅中水解2-6h，水解温度设置在50-90℃，待水解后离心得下层沉淀物；

步骤二、将步骤一所得沉淀物用蒸馏水洗至中性，再加入200ml85％的乙醇溶液，在60℃下浸提2h后，离心弃下层沉淀，得上清浸提液；并将上浸提清液置于4℃下冷却沉淀4h，离心得上清液；

步骤三、将步骤二所得上清液减压浓缩至10-20ml，然后将所得浓缩液加入10倍量70℃蒸馏水，搅拌混匀后冷却至室温，然后置于4℃下冷却沉淀12h，离心取沉淀，冷冻干燥36h，得到提取粉末，即鸢尾苷元。

上述技术方案中，步骤一中，盐酸溶液的浓度为1.5mol/l，水解温度为90℃，水解酸解为6h。

上述技术方案中，步骤一中，葛花粉末的质量/g与hcl的物质的量/mmol的比值为1/40(g/ml)。

上述技术方案中，步骤一中，葛花粉末的质量为10g，hcl的物质的量为400mmol。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、从葛花中直接获取鸢尾苷元，不经鸢尾苷的提取步骤，工艺简单；同时单位质量葛花所得的鸢尾苷元大于单位质量葛花所得的鸢尾苷，且鸢尾苷元功能活性优于鸢尾苷。

2、本发明提高了从葛花中直接获得鸢尾苷元的提取率，提取率高达1.89±0.09％。

附图说明

图1为本发明中不同酸解温度对鸢尾苷元得率的影响；

图2为本发明中不同酸解时间对鸢尾苷元得率的影响；

图3为本发明中不同盐酸浓度对鸢尾苷元得率的影响；

图4为本发明中不同料液比对鸢尾苷元得率的影响；

图5为实施例中提取物红外扫描图谱；

图6a为实施例中鸢尾苷元标准品的lc-mc母离子峰；图6b为本发明中提取物的lc-mc母离子峰；

图7a为实施例中鸢尾苷元标准品的lc-mc子离子峰；图7b为本发明中提取物的lc-mc子离子峰；

图8a为实施例中鸢尾苷元标准品的lc-mc特征离子；图8b为本发明中提取物的lc-mc特征离子；

图9为实施例中鸢尾苷、鸢尾苷元的还原能力；

图10为实施例中鸢尾苷、鸢尾苷元清除dpph自由基的能力；

图11为实施例中鸢尾苷、鸢尾苷元清除abts+自由基的能力；

图12为实施例中鸢尾苷和鸢尾苷元对酪氨酸酶的抑制效果；

图13为实施例中鸢尾苷元提取物的hplc图谱。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本发明是如何实施的。

本发明提供一种从葛花中直接提取鸢尾苷元的方法，通过酸化水解法直接从葛花中直接提取鸢尾苷元，无需经葛花中鸢尾苷的中间提取步骤。

本发明提供一种从葛花中直接提取鸢尾苷元的方法，包括以下步骤：

步骤一、将葛花粉碎过60目筛，称取葛花粉末加入到0.1-2.0mol/l的盐酸溶液(hcl的水溶液)中，然后置于恒温水浴锅中水解2-6h，水解温度设置在50-90℃，待水解后离心得下层沉淀物；

步骤二、将步骤一所得沉淀物用蒸馏水洗至中性，再加入200ml85％的乙醇溶液，在60℃下浸提2h后，离心弃下层沉淀，得上清浸提液，即乙醇浸提液；并将上清液至于4℃，冷却沉淀4h，离心得上清液；

步骤三、将步骤二所得上清液减压浓缩至10-20ml，然后将所得浓缩液加入10倍量70℃蒸馏水，搅拌均匀后冷却至室温，然后置于4℃下冷沉12h(由于鸢尾苷元极性小、亲水性差，可采用水沉除去亲水性物质)，离心取沉淀，冷冻干燥36h，得到提取粉末，即鸢尾苷元。

本发明中采用hplc测定鸢尾苷元的得率：

将步骤二中所得85％乙醇浸提液定容至250ml，0.45μm微孔滤膜过滤后，经hplc测定得率。

式中：c为浸提液中鸢尾苷元的浓度，mg/ml；m为葛花质量，mg。

其中，hplc检测条件：色谱柱：hypersilbds(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水(40：60)；检测波长：265nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。

(1)本发明通过单因素法研究对鸢尾苷元提取的影响因素，发现酸化水解法从葛花中提取鸢尾苷元的过程中，盐酸溶液浓度为1mol/l，水解温度为90℃，水解酸解为6h以及葛花粉末的质量与盐酸溶液的物料比均影响鸢尾苷元的提取率。具体如下：

一、水解温度影响

准确称取葛花原料5份，每份粉末各10g，向每份粉末中添加1mol/l的盐酸溶液200ml，分别在温度为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的条件下，恒温水浴，酸解时间为5h，测定鸢尾苷元的得率随温度的变化，其结果如图1所示。

由图1可知，鸢尾苷元的得率随温度的变化十分显著(p<0.05)，其得率随着酸解温度的增加逐步提高。当酸解温度较低时(50℃、60℃)，鸢尾苷元得率小于0.5％；当温度从60℃提高至90℃的过程中，鸢尾苷元得率有明显提高，升至80℃时，约有1.5％；当温度达到90℃时，大部分鸢尾苷都水解为鸢尾苷元，鸢尾苷元的得率可以达到1.8％以上。同时，浸提温度较高时可以使一些杂质充分分解，或溶解于热水中，从而提高了鸢尾苷元提取物的纯度。因此选择90℃为最佳酸解温度。

二、酸解时间

准确称取葛花原料5份，每份粉末各10g，向每份粉末中添加1mol/l的盐酸溶液200ml，置于80℃的水浴锅中，分别恒温酸解2h、3h、4h、5h、6h，测定鸢尾苷元得率随酸解时间的变化，其结果如图2所示。

由图2可知，酸解时间对鸢尾苷元得率的影响具有显著性(p<0.05)，鸢尾苷元的得率随酸解时间的增加而呈逐步提高的趋势。酸解时间较短时(2h)，鸢尾苷元得率小于1％，当酸解时间延长至6h时，鸢尾苷元得率升至1.76％。所以，选择6h为最佳酸解时间。

三、盐酸溶液浓度

准确称取葛花原料5份，每份粉末各10g，分别加入浓度为0.1mol/l、0.5mol/l、1mol/l、1.5mol/l、2mol/l的盐酸溶液200ml，置于80℃的水浴锅中，恒温酸解5h，测定鸢尾苷元得率随盐酸浓度的变化，其结果如图3所示。

由图3可知，盐酸浓度对鸢尾苷元的得率的影响十分显著(p<0.05)。随着盐酸浓度的提高，鸢尾苷元的得率呈上升趋势。当盐酸浓度增加到1.5mol/l时，鸢尾苷元得率为1.77％，之后得率的增加的速率明显减缓。虽然在2mol/l盐酸浓度下，鸢尾苷元得率仍有些许增加，但在高盐酸浓度长时间作用下，鸢尾苷元会分解，失去活性，并且出于成本和安全性考虑，选择1.5mol/l为最佳盐酸浓度。

四、料液比

准确称取葛花粉末10g，共5份，分别加入浓度为1mol/l的盐酸溶液100ml、200ml、300ml、400ml、500ml，置于80℃的水浴锅中，恒温酸解5h，测定鸢尾苷元得率的变化，其结果如图4所示。

由图6可知，鸢尾苷元得率随料液比(葛花质量：hcl物质的量，g/mmol)呈不规则变化，当料液比为1:10时，得率仅为1.18％；当1:20时，得率有所升高；在料液比为1:30时，得率有所回落；其中以料液比为1:40时，得率最高，为1.51％；料液比为1:50时，得率为1.5％。因此，处于成本考虑，选择1:40作为最佳提取料液比。

具体实施例

本实施例提供一种从葛花中直接提取鸢尾苷元的方法，包括以下步骤：

步骤一、将葛花粉碎过60目筛，称取10g葛花粉末加入到1.5mol/l的盐酸溶液267ml(1/40)中，然后置于恒温水浴锅中水解6h，水解温度设置在90℃，待水解后离心得下层沉淀物；

步骤二、将步骤一所得沉淀物用蒸馏水洗至中性，再加入200ml85％的乙醇溶液，在60℃下浸提2h后，离心弃下层沉淀，得上清浸提液，即乙醇浸提液；并将上清液至于4℃，冷沉4h，离心得上清液；

步骤三、将步骤二所得上清液减压浓缩至20ml，然后将所得浓缩液加入10倍量70℃蒸馏水，搅拌均匀后冷却至室温，然后置于4℃下冷沉12h(由于鸢尾苷元极性小、亲水性差，可采用水沉除去亲水性物质)，离心取沉淀，冷冻干燥36h，得到提取粉末，即鸢尾苷元。

本实施例中，将步骤二中所得85％乙醇浸提液定容至250ml，0.45μm微孔滤膜过滤后，经hplc测定鸢尾苷元得率为1.89±0.09％。

现有技术中，鸢尾苷的制备方法一般为：取葛花100g置于三颈瓶中，加入溶剂1:1(v/v)n-正丁醇相/水1000ml，在浸取温度为70℃的条件下回流提取1.5h。浸取液过滤后静置平衡，分出正丁醇相。将过滤得到的正丁醇相用旋转蒸发到100ml，浓缩相在室温下放置12h，得到异黄酮的冷却结晶，过滤干燥得粉末。干燥的粉末采用甲醇重结晶。得到固形物，自然晾干，即得鸢尾苷。本实施例采用现有技术制得鸢尾苷，得率为0.62％。

本实施例中，鸢尾苷元性能测试：

(1)结构鉴定

1.1显色反应鉴定结果

对实施例中所得提取物进行三氯化铁反应和盐酸-镁粉反应测定，反应现象及结果见表1。

表1显色反应现象及结果

如表1所示，三氯化铁反应时出现红色，说明提取物中存在黄酮类化合物；盐酸-镁粉反应测定时出现黄绿色，说明提取物中存在酚羟基；结果表明，提取物中存在鸢尾苷元的官能团。

1.2红外扫描

将提取粉末制样进行红外测试，红外扫描图谱如图5所示：3281cm-1为o-h伸缩振动的特征吸收；2924cm-1为-ch3的吸收；1646cm-1为共轭酮羰基伸缩振动的特征吸收；1616cm-1、1565cm-1、1514cm-1和1465cm-1为芳环骨架振动的特征吸收；1062cm-1为c-o-c的吸收。结果表明，提取物中存在鸢尾苷元的官能团。

1.3hplc-ms鉴定结果

shupan等分析鸢尾中黄酮和酚酸类成分，实验方法为电喷雾多级质谱法，确定了鸢尾苷元的碎片离子为286、229、168和159。

通过液质联用测定鸢尾苷元对照品和提取物，得到相应的正离子质谱图，图6a和图6b中分别给出的鸢尾苷元对照品和提取物的母离子均为m/z301.00(m+h)+，确定鸢尾苷元分子量为300.00。

如图7a和7b所示，鸢尾苷元对照品和提取物的特征离子对均为m/z167.95(m+h)+和m/z286.00(m+h)+。m/z167.95(m+h)+和m/z286.00(m+h)+分别为m/z301.00(m+h)+失去一个质量数133.05和15的中性碎片生成的离子峰。

如图8a和8b所示，鸢尾苷元对照品和提取物经hplc在其相应保留时间的子离子峰，显示结果完全一致，证明该提取物的主要成分确实为鸢尾苷元。

(2)功能鉴定

2.1鸢尾苷、鸢尾苷元的还原力测定结果分析

分别测定0.005mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml的鸢尾苷、鸢尾苷元和维生素c还原力的大小。其中鸢尾苷、鸢尾苷元为本实施例所制，维生素c可于市场购置；由图9可知，随三种物质浓度的提高，它们的还原能力均呈上升趋势，而且显著性相关(p<0.05)。在0mg/ml～0.15mg/ml的浓度范围内，还原力大小顺序是：维生素c>鸢尾苷元>鸢尾苷。

2.2鸢尾苷、鸢尾苷元对dpph的清除能力测定结果分析

抗氧化剂分子结构中羟基供氢能力的大小会影响着dpph自由基的清除作用。在室温下，dpph自由基通常是稳定的，在其被溶于乙醇之后，颜色呈深紫色，可以在波长517nm处检测到有最大吸收值。当h质子或子与dpph结合之后，溶液的颜色会逐渐变浅，溶液变浅的程度与dpph结合质子或电子的数目成正比例关系(hanetal2012；李熊利2012)。所以，为了体现抗氧化能力的大小，我们可以将dpph·溶液加入样品的前后吸光值进行比较，根据其差值来对物质提供氢质子的能力进行评价。

测定不同浓度的(0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml)鸢尾苷、鸢尾苷元清除dpph自由基的能力；其中鸢尾苷、鸢尾苷元为本实施例所制，维生素c可于市场购置。鸢尾苷、鸢尾苷元和阳性对照维生素c清除dpph自由基的能力如图10所示。

由图10可知，三种物质清除dpph自由基的能力大小均随着物质浓度增加，而增加。当维生素c的浓度小于0.01mg/ml时，其对dpph自由基的清除率大小随着浓度的增加迅速提高；而当鸢尾苷、鸢尾苷元的浓度大于0.01mg/ml时，两者对dpph自由基清除率的差别才明显。鸢尾苷、鸢尾苷元和维生素c的ic50值分别为69.36μg/ml、46.34μg/ml和5.65μg/ml，清除dpph自由基能力的强弱表现为维生素c>鸢尾苷元>鸢尾苷。因而，为了从葛花中不经鸢尾苷的提取步骤，而直接获取鸢尾苷元的技术路线是具有科学性和可行性的，这项研究对于使葛花中异黄酮活性的增加具有深远的影响。

2.3鸢尾苷、鸢尾苷元对abts自由基的清除能力结果分析

清除abts+自由基能力是目前常用的一种用来评判物质的总抗氧化能力大小的指标。被氧化的abts可以变为abts阳离子自由基，是十分稳定的，但当它溶于水相体系后，溶液颜色表现为蓝绿色，可以在波长734nm处检测到有最大吸收值。该试验就是利用抗氧化活性可以通过物质将abts+自由基还原程度来进行计算的。所以，abts+自由基被还原时，造成的溶液颜色褪色的情况，就是该实验的现象表达，具体表现为吸光值降低，吸光值变小，下降程度越大表明物质清除abts+自由基的能力越强。

用95％乙醇配制浓度分别为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml的鸢尾苷、鸢尾苷元和维生素c溶液；其中鸢尾苷、鸢尾苷元为本实施例所制，维生素c可于市场购置。鸢尾苷、鸢尾苷元和阳性对照维生素c清除abts+自由基的能力如图11所示。

由图11可知，当浓度范围在0mg/ml～0.2mg/ml之间时，鸢尾苷、鸢尾苷元和维生素c对abts+自由基的清除率均呈上升趋势。鸢尾苷、鸢尾苷元和维生素c的ic50值分别为135.31μg/ml、45.59μg/ml和44.62μg/ml。当物质浓度小于0.05mg/ml时，清除abts+自由基能力大小为鸢尾苷元>维生素c>鸢尾苷；但当浓度大于0.05mg/ml时，维生素c清除abts+自由基的能力明显高于鸢尾苷和鸢尾苷元，并且鸢尾苷元的能力强于鸢尾苷。此结果表明，鸢尾苷和鸢尾苷元均具有抗氧化能力，能够提供氢质子和终止自由基链式反应。

2.4鸢尾苷、鸢尾苷元对酪氨酸酶抑制率的影响

用磷酸盐缓冲液、丙二醇和乙酸乙酯配置浓度1g/l、1.5g/l、2g/l、2.5g/l、3g/l的鸢尾苷、鸢尾苷元和维生素c溶液，以维生素c作为阳性对照，测定它们对酪氨酸酶的抑制率；其中鸢尾苷、鸢尾苷元为本实施例所制，维生素c可于市场购置。

由图12可知，随着鸢尾苷和鸢尾苷元浓度的增加，其对酪氨酸酶的抑制率并非呈逐步增加的趋势，即部分功能因子当含量过高时会对酪氨酸酶产生抑制作用，这也被称为双向作用。鸢尾苷、鸢尾苷元和维生素c的ic50值分别为2.62mg/ml、1.39mg/ml和0.51mg/ml。本试验中鸢尾苷元对酪氨酸酶的抑制率随着浓度的提高而提高，但在升至最高点后会出现回落，究其根源，由于在没有达到峰值时，提高鸢尾苷元的浓度会增强其对酪氨酸酶的抑制效果，而在3mg/ml时，鸢尾苷元对酪氨酸酶的抑制率下降，则说明其具有双向作用，导致抑制率曲线出现波动，抑制率有所下降。而鸢尾苷对酪氨酸酶的抑制率虽然在浓度为2mg/ml时出现了波动现象，但整体呈上升趋势，原因是由于试验中鸢尾苷的浓度未达到激活酪氨酸酶的浓度，所以在3mg/ml时并未出现下降趋势。将阳性对照品维生素c的抑制率与鸢尾苷、鸢尾苷元进行对比，鸢尾苷元在中间浓度2mg/ml和2.5mg/ml时，其对酪氨酸酶的抑制效果可以达到95％以上，效果与维生素c相似。而在任何浓度下，维生素c的抑制效果都比鸢尾苷的抑制效果要好。鸢尾苷仅在浓度为1mg/ml时，抑制效果要比鸢尾苷元强，这是由于试验中未涉及鸢尾苷元低浓度的抑制率测定，而在低浓度时，鸢尾苷元抑制作用存在一定的波动，从而出现部分浓度的抑制作用小于鸢尾苷的情况；随着样品浓度的增大，鸢尾苷元的抑制率均高于鸢尾苷，也符合鸢尾苷元活性高于鸢尾苷的结论。

由上述功能鉴定实验可知，鸢尾苷元在还原力、清除dpph自由基的能力、清除abts+自由基的能力和对酪氨酸酶的抑制率等方面均高于鸢尾苷，说明鸢尾苷元活性高于鸢尾苷。

综上所述，通过本发明所提供的方法直接制备鸢尾苷元，单位质量葛花所得的鸢尾苷元大于单位质量葛花所得的鸢尾苷，并且鸢尾苷元功能活性优于鸢尾苷。

本发明中，采用hplc进行鸢尾苷元纯度鉴定：

纯度鉴定实验描述：取本发明所得鸢尾苷元，利用高效液相色谱法(hplc)得到鸢尾苷元提取物的hplc图谱，测定鸢尾苷元标准液的峰面积a，绘制峰面积a(mv*min)随着样品浓度(mg/ml)变化而变化的曲线。得到回归方程：y＝3×107x-76045，r2＝0.9997；线性范围：21.2mg/l～106mg/l；根据绘制的回归方程y＝3×107x-76045计算样品纯度，提取物纯度为55-90％。

从图13中可以看出，本实施例所得鸢尾苷元提取物的甲醇溶液出现2个杂质峰，根据绘制的回归方程y＝3×107x-76045计算样品纯度，提取物纯度为88.78％(保留时间为27.890min)，杂质的保留时间分别为6.083min和18.782min。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。