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一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法及其引物.pdf

花匠小妙招
2025-02-19 17:05

一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法及其引物

【技术领域】

本发明涉及植物病毒的分子生物学检测和鉴定技术领域，具体涉及凤仙花坏死斑病毒的分子生物学检测和鉴定的方法及其引物。

背景技术

凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)最早从有症状的凤仙花上分离鉴定出来，可以侵染50科648种植物，其中观赏植物39个属，是国外花卉生产中最难解决的问题之一。该病毒为三分体基因组，其中ssRNA-L(8.9kb)为负义，ssRNA-M(4.8kb)和ssRNA-S(2.9kb)为双义。L片段编码一个332kDa的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)；M片段的互补链RNA编码两个糖蛋白G1和G2，病毒链RNA编码33.6kDa非结构蛋白NSm；S片段的互补链RNA编码28.8kDa外壳蛋白(NP)，病毒链RNA编码52.4kDa非结构蛋白NSs。1998年，INSV病毒被欧洲及地中海植物保护组织(European andMediterranean Plant Protection Organization，EPPO)列入A2类检疫性有害生物。

目前，传统生物学测定是进行病毒检测常用的一种方法，主要是通过观察鉴别寄主在接种后的症状反应，以及其他生物学指标，如病毒传播途径、介体昆虫的种类、病毒寄主范围、体外保毒期、稀释限点、钝化温度及与已知病毒的交叉保护作用和细胞质内含体形态等，作为病毒鉴定的标准。但它在检测特定病毒时需要的特定鉴别寄主不易得到，且耗时，已不能适应生产上对快速检测的需要。不同病毒在同种植物上常产生相同症状；同种病毒在植物的不同栽培品种上的症状不尽一致：同种病毒的不同株系可产生不同症状；复合侵染及病毒卫星RNA会影响症状表现；病毒常会产生潜隐侵染：不同土壤和气候条件可改变症状表现等，使准确检测和鉴定病毒较困难。

电镜技术是通过观察植物病毒颗粒形态、大小、结构、内含体组成和亚结构等方面的特征来确定病毒是否存在。利用电镜法鉴定植物病毒的优点是快速、简单和直接，可以直观地观察病毒形态结构以及病毒侵染寄主后引起的细胞超微结构变化，可以较明确的显示超微结构水平的细胞病理变化。但电镜操作需要一定技能，而且工作比较集中，样本数量不易太大。免疫电镜技术的检测灵敏度与ELISA(酶联免疫吸附测定法)反应相似，但不如核酸杂交技术。同时，依据病毒粒子的大小和弯曲程度一般只能判断到科或属.对于球状病毒，因其形态相似很难直接利用电镜确定，只能根据粒子外形进行初步判断，另外并不是每一种病毒侵染植物都会形成内含体等特定结构，而且电镜并不是每个实验室都能配备，这也在一定程度上制约了电镜技术在病毒检测中的广泛应用。

利用PCR(聚合酶链反应，Polymerase Chain Re-action简称PCR)和RT-PCR(反转录聚合酶链反应，reverse transcription-PCR，简称RT-PCR)方法检测植物病毒具有灵敏、快速、特异性强等优点，其专一性和灵敏性则优于免疫学方法。中国专利申请号为200810058612.0的“快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法”(其公开号为CN101307366A，公开日为2008年11月19日)建立了凤仙花坏死斑病毒的RT-PCR和巢式PCR技术，其特异性和灵敏度均比常规方法优越，但是由于设计的2对引物均是INSV病毒三分体基因组中S RNA的N基因的片段，造成引物设计的局限性，使得必须经过测序和比对后方能避免实验结果的假阳性。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中检测凤仙花坏死斑病毒的RT-PCR和巢式PCR技术引物设计的局限性致使假阳性结果出现的缺陷，提供一种应用特异性引物的准确快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒病的方法。

为解决上述技术问题，本发明有下列技术方案：

1、一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的专用引物L6，所述的专用引物L6是由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQID NO：1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为744bp。

2、一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的专用引物M6，所述的专用引物M6是由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为637bp。

3、一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的专用引物S3，所述的专用引物S3是由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQID NO：5所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为542bp。

4、一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法，包括提取植物样品的总RNA，用引物进行RT-PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆和测序PCR扩增产物，进行序列比对，其特征在于：在所述的用引物进行RT-PCR扩增中所用的引物是权利要求1所述的专用引物L6。

5、一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法，包括提取植物样品的总RNA，用引物进行RT-PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆和测序PCR扩增产物，进行序列比对，其特征在于：在所述地用引物进行RT-PCR扩增中所用的引物是权利要求2所述的专用引物M6。

6、一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法，包括提取植物样品的总RNA，用引物进行RT-PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，克隆和测序PCR扩增产物，进行序列比对，其特征在于：在所述的用引物进行RT-PCR扩增中所用的引物是权利要求3所述的专用引物S3。

7、一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法，由提取植物样品的总RNA，用引物进行RT-PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，其特征在于：在所述的用引物进行RT-PCR扩增中是分别用权利要求1所述的专用引物L6，权利要求2所述的专用引物M6和权利要求3所述的专用引物S3进行扩增，在RT-PCR反应终止后，分别取5μl PCR产物，用琼脂糖电泳检测扩增结果，如果扩增片段大小分别为744bp、637bp和542bp，则该植物样品为凤仙花坏死斑病毒所侵染。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)本发明根据病毒基因组中L、M、S RNA分别设计3对引物，分别通过这3对引物进行RT-PCR扩增分别可以得到L RNA(片段长度：744bp)、M RNA(片段长度：637bp)、S RNA(片段长度：542bp)，用其中单独一对引物能够定性检测凤仙花坏死斑病毒，与传统的生物学和电镜技术检测鉴定方法相比，不仅准确，可靠，特异性强，而且不受寄主植物的影响，能有效地排除假阳性的干扰，适用的植物寄主检测范围广。

(2)本发明与中国专利申请号为200810058612.0的“快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法”相比较，后者设计的2对引物均是INSV病毒三分体基因组中S RNA的N基因的片段，具有一定的局限性，必须经过测序和比对后方能避免实验结果的假阳性，而用本发明的3对引物同时检测该病毒时，如果能够扩增出744bp、637bp和542bp左右的片段，不需再进行克隆、测序和序列比对，即可确认样品为INSV，完全可以避免RT-PCR检测中假阳性的结果，其特异性和灵敏度均比申请号为200810058612.0所述的方法更加准确和优越，更简化了检测过程和实验成本。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是本发明的专用引物L6的上游引物的碱基序列；

序列表中SEQ ID NO：2所示的是本发明的专用引物L6的下游引物的碱基序列；

序列表中SEQ ID NO：3所示的是本发明的专用引物M6的上游引物的碱基序列；

序列表中SEQ ID NO：4所示的是本发明的专用引物M6的下游引物的碱基序列；

序列表中SEQ ID NO：5所示的是本发明的专用引物S3的上游引物的碱基序列；

序列表中SEQ ID NO：6所示的是本发明的专用引物S3的下游引物的碱基序列。

【附图说明】

图1是应用引物对L6对样品进行RT-PCR扩增，对得到的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果。M为Marker，L6为L6特异性引物经PCR后的电泳条带。

图2是应用引物对M6对样品进行RT-PCR扩增，对得到的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果。M为Marker，M6为M6特异性引物经PCR后的电泳条带。

图3是应用引物对S3对样品进行RT-PCR扩增，对得到的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳结果。M为Marker，S3为S3特异性引物经PCR后的电泳条带。

【具体实施方式】

以下结合实施例对本发明作进一步描述，便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。

下列实施例中实验方法，均为常规方法，所用试剂、材料，均能从生化试剂商店购买到。

实施例1本发明快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的专用引物L6及其设计和用该专用引物L6检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法

(1)专用引物L6及其设计与合成

专用引物L6是根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)的三分体基因组中RNA L片段在Genbank报道的INSV(登录号：NC_003625)，使用Primer 5设计的引物，将其编号为专用引物L6，它是由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述的专用引物L6的目标产物片段长度为744bp。

上述专用引物L6由大连宝生物工程有限公司合成。

(2)用专用引物L6检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法，按以下步骤进行

①合成上述步骤(1)所述的专用引物L6。该专用引物L6由百泰克生物技术有限公司合成。

②样品的采集

本带毒植物样品取自云南省昆明市呈贡县斗南花卉市场中具有同心环纹的INSV病毒典型症状的蝴蝶兰(Phalaenopsis sp.)植株。

③RNA的提取

应用Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit(购置于GE Healthcare公司，即现在的通用电气有限公司，原安玛西亚生物科技有限公司)从上述步骤(2)中②取得的新鲜植株组织中提取RNA，操作步骤根据GE Healthcare公司提供的使用说明操作，并在RNA溶解溶液中加入了3.5μl β-巯基乙醇，每500μl RNA裂解溶液2g植物组织。

④RT-PCR反应

本实验用宝生物工程(大连)有限公司，(即大连TaKaRa公司)提供的试剂盒的一步反应法(One Step法)完成RT-PCR反应。RNA→cDNA→PCR反应操作在同一反应体系中进行，反应中途不需添加任何试剂，就可以完成由AMV反转录酶从RNA反转录为cDNA，再由AMV-Optimized Taq(LA PCR技术研制)扩增cDNA的全部反应。通过上述专用引物L6进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系：

RT-PCR反应条件：

50℃ 30min.RT反应

94℃ 2min.RTase失活

72℃ 2min.

72℃ 10min.

⑤电泳检测

RT-PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出744bp左右的片段即为INSV，如图1。

⑥克隆和测序

用QIAquick PCR纯化试剂盒(购于Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)纯化PCR扩增产物，pGEM-T载体(购于Promega，Madison，WI，USA)连接，并通过Escherichia coli细胞(JM-109)转化，用标准生物学操作程序，由北京百泰克生物有限公司用AB13370DNA自动测序仪进行测序。

⑦序列比对

将获得的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析。与Genbank报道的序列号为DQ425094.1、GQ336991.1、X93218.1的INSV的一致性分别为99％、99％和98％。证明该样品为INSV病毒感染。

实施例2本发明快速准确检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的专用引物M6及其设计和用该专用引物M6检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法

(1)专用引物M6及其设计与合成

专用引物M6是根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)的三分体基因组中RNA M片段在Genbank报道的INSV，登录号为NC_003624，使用Primer 5设计的引物，将其编号为专用引物M6，它是由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，所述的专用引物M6的目标产物片段长度为637bp。

上述专用引物M6由百泰克生物技术有限公司合成。

(2)用该专用引物M6检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法，该方法除合成的专用引物和RT-PCR反应中使用的专用引物是上述专用引物M6外，其余操作步骤及其条件等与实施例1(2)中②至⑦相同，不再赘述。该RT-PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增出637bp左右的片段即为INSV，如图2。通过序列比对，与Genbank报道的序列号为GU112503.1、GQ336990.1、DQ425095.1的INSV的一致性分别为99％、97％和97％。证明该样品为INSV病毒感染。

实施例3本发明快速准确检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的专用引物S3及其设计和用该专用引物S3检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法

(1)专用引物S3及其设计与合成

专用引物S3是根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)的三分体基因组中RNA S片段在Genbank报道的INSV，登录号为NC_003624，使用Primer 5设计的引物，将其编号为专用引物S3，它是由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，所述的专用引物S3的目标产物片段长度为542bp。

上述专用引物S3由百泰克生物技术有限公司合成。

(2)用该专用引物S3检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法，该方法除合成的专用引物和RT-PCR反应中使用的专用引物是上述专用引物S3外，其余操作步骤及其条件等与实施例1(2)中②至⑦相同，不再赘述。该RT-PCR反应终止后，取5μl PCR产物，1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增出542bp左右的片段即为INSV，如图3。通过序列比对，与Genbank报道的序列号为GU112504.1、GQ336989.1、DQ425096.1的INSV的一致性分别为99％、99％和98％。证明该样品为INSV病毒感染。

实施例4用本发明的3对专用引物检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法

在用引物进行RT-PCR扩增时分别用本发明的3对专用引物，即分别用实施例1所述的专用引物L6，实施例2所述的专用引物M6和实施例3所述的专用引物S3进行RT-PCR扩增，方法操作步骤及其条件等与实施例1(2)中②至⑤相同，不再赘述。RT-PCR反应终止后，分别取5μl PCR产物，用1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增出744bp、637bp和542bp左右的片段即为INSV，如图1、图2、图3。

实验结果判断：检测过程中如果只选择用本发明的3对引物中任一对引物，除了RT-PCR扩增片段大小必须和预测片段一致外，应该进行克隆、测序，将所获得的片段进行序列比对，才能确定待测样品是否为INSV，以避免实验结果的假阳性出现。但是如果用本发明的3对引物做RT-PCR，得到的3个扩增片段大小都与目标片段一致，就可以确定该样品是INSV，而不需要再进行克隆、测序和序列比对，简化了检测过程和实验成本。

表1专用引物L6，专用引物M6，专用引物S3以及其序列表：

【序列表】

<110>云南农业大学

<120>一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法及其引物

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA