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（果树学专业论文）砂梨组织培养及遗传转化研究.pdf

花匠小妙招
2025-02-26 02:05

文档简介

浙江火学硕l 学位论文( 2 0 0 5 ) 摘要梨( p y f u ss p p ) 是世界性重要果树，我国是梨主产国。梨果色、香、味、质俱佳，很受消费者欢迎，在果品市场占据重要地位。砂梨( p y r u s p y r i f o l i an a k a i ) 品种早实性较强、抗热、抗火疫病能力强。但现有的砂梨品种还存在很多不足之处，如对霜害的抗性差、抗病性不强、果实外观较差等。随着现代生物技术的发展，植物转基因技术已得到广泛应用，使通过生物工程方法培育具有优良性状的果树新品种成为可能。因此本研究也运用这一思路开展砂梨组培与转基因研究。奉研究以我国南方砂梨主栽品种翠冠、雪青、西子绿为试材，建立了砂梨叶片再生体系，并在此基础上，初步研究了砂梨叶片农杆菌介导的条件，旨在探索砂梨根癌农杆菌介导的遗传转化方法。主要研j 究结果如下： 1 以翠冠、雪青、西子绿3 个砂梨栽培品种为试材，研究了品种、暗培养时间、不同激素配比、培养基类型、硝酸银、糖源、损伤方式等对砂梨叶片再生能力的影响。结果表明：翠冠的再生能力最强，其次为雪青，西子绿最差；定时期的暗培养是翠冠叶片再生的必要条件；n a a 浓度不变，b a 浓度在3 7m g l 之间变化时，翠冠离体叶片再生频率有提高的趋势：t d z 对翠冠离体叶片再生不定梢促进作用甚小；常规培养基m s 最适于砂梨品种翠冠的再生；a g n 0 3 浓度在0 1 0 5m g l 对叶片再生有一定的促进作用。 2 对翠冠再生过程不同时期的叶片样品进行扫描电子显微镜观察，结果表明在试验开始的1 0d 后就出现了类分生组织结构，在2 个月后观察到充分发育的梢，且最终形成的梢的数量远少于所形成的分生组织数量。 3 通过c e f 对翠冠叶片愈伤组织诱导及不定梢分化的影响实验以及叶片对 k a n 抗性预备实验，基本上确定遗传转化中抗生素最佳使用浓度为c e f2 0 0 m g l 、k a n2 5m g ，l 。以砂梨品种翠冠叶片为根癌农杆菌介导转化受体，感染了近干张叶片，但由于其再生频率太低，目前尚未得到抗性芽。初步探索了甘露糖对砂梨愈伤组织诱导及不定梢分化的影响，发现三个品种均1 i 能利用甘露糖，因而具备应用磷酸甘露糖异构酶( p m d 筛选体系的前提条件。本研究首次利用扫描电子显微技术对砂梨叶片不定梢再生过程进行了观察，有助于我们更加绌致地从形态学上了解器官再生的动态过程，以寻求最佳途径提高不定梢的再生频率。浙江大半硕：学位论文( 2 0 0 5 ) 梨树基因转化工作难度较大，进展相当缓慢，目前国内尚未有关于梨树转基因的报道。国外少量相关报道也仅限于西洋梨和豆梨。奉研究首次探讨了砂梨遗传转化条件，初步筛选出适合我国南方主栽品种翠冠的抗生素使用浓度，可能对其它梨品种的遗传转化也有一定的借鉴作用。浙江人学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) a b s t r a c t p e a r ( v y r g ss p p ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf r u i t si nt h ew o r l da n da l s oa f a m o u sf r u i ti nc h i n a e x c e u e n tq u a l i t y , a t t r a c t i v ec o l o r , g o o dt a s t ea n dm a r v e l o u s f r a g r a n c em a k ei tap o p l u l a rf r u i ti nt h em a r k e t s a n dp e a r ( p y r u sp y r i f o l i an a k a l ) c u l t i v a r sa l s oh a v eo t h e rc h a r a c t e r i s t i c ss u c ha se a r l i e rf r u i tr i p e n i n g ，a n t i h e a ta n d a n t i f i r eb l i g h t b u tm o s tc u l t i v a r so fs a n dp e a rs t i l lh a v eal o to fs h o r t a g e ss u c ha s s e n s i t i v et of r o s ta n dd i s e a s e s ，b a da p p e r a n c eo ff r u i ta n ds oo n w i t ht h ed e v e l o p m e n to fb i o t e c h l o l g y ，p l a n tg e n et r a n s f e rt e c h n i q u eh a sb e e n u s e df a ra n dw i d e l y s oi t a p p e a r sp r o m i s i n gt h a tb r e e d i n gf r u i tn e wc u l t i v a rw i t h e x c e l l e n tt r a i t sb y b i o t e c h l o l g y s ot h i sr e s e a r c hd e s c r i b e ds a n dp e a r t i s s u ec u l t u r ea n d g e n et r a n s f o r m a t i o nt e c h n i q u e s h o o t sw e r er e g e n e r a t e df r o mt h ey o u n gl e a v e so f s a n dp e a rc v c u i g u a n ，x u e q i n g b a s e do nr e g e n r a t i o ns y s t e m ，t h ec o n d i t i o no f a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nw e r ee x p l o r e d t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e d b e l o w 1 a d v e n t i t i o u ss h o o tr e g e n e r a t i o nf r o mi n v i t r ol e a v e so fs a n dp e a rc v c u i g u a n ， x u e q i n g a n d x i z i l v w a ss t u d i e d a m o n g t h et h r e ec u l t i v a r s c u i g u a n s h o w e dt h e r e l a t i v e l yh i g h e rr e s p o n s et or e g e n e r a t i o n ，x u e q i n g r e l a t i v e l yl o w e r ，a n dn or e s p o n s e f o r x i z i l v d a r kt r e a t m e n tw a sn e c e s s a r yf o rr e g e n e r a t i o no f c u i g u a n l e a v e si n t h ee x p e r i m e n t w h e nn a ac o n c e n t r a t i o nw a sf i x e da n db ac o n c e n t r a t i o nw a s c h a n g e df r o m3m g m t o7m g l ，a d v e n t i t i o u ss h o o tr e g e n e r a t i o nr a t ef r o mi n - v i t r o l e a v e so f c u i g u a n w a si n c r e a s e ds t e a d i l y t h ee f f e c to ft d zo nr e g e r t r a t i o nf r o m i n v i t r ol e a v e so f c u i g u a n w a sv e r ys m a l l m sw a so p t i m a lm e d i u mo nr e g e n r a f i o n f r o mi n v i t r ol e a v e so f c u i g u a n a g n 0 3e n h a n c e dt h er e g e n e r a t i o ne f f i c i e n c yo f l e a v e sw h i l ei t sc o n c e n t r a t i o n sv a r i e df r o m0 i m g l t o0 5m g l 2 s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) o b s e r v a t i o no n c u i g u a n r e v e a l e d t h a t m e r i s t e m l i k es t r u c t u r e sw e r ea l r e a d yv i s i b l ea td a y1 0 a f t e rt h ei n i t i a t i o no ft h e e x p e r i m e n tm a dw e l l d e v e l o p e ds h o o t sw e r eo b s e “ e da f t e rt w om o n t h s s e ma l s o s h o w e dt h a tm o r em e r i s t e m sw e r eo b s e r v e dt h a nt h es h o o t se v e n t u a l l yf o r m e df r o m t h a m 3 浙江大学碛：学位论史c 2 0 0 5 、 3 t h r o u g he x p e r i m e n t so f t h ee f f e c to fc e fo nc a l l u si n d u c t i o na n ds h o o t r e g e n e r a t i o n f r o ml e a v e s o f c u i g u a n a n dt h e e f f e c to fk a no nc a l l u s i n d u c t i o n ，o p t i m a c o n c e n t r a t i o n so fc e fa n dk a nw e r ee s t a b l i s h e d ，2 0 0r a g la n d2 5m g l r e s p e c t i v e l y a b o u t1 0 0 0 p i e c e so f l e a v e s o f c u i g u a n w e r ei n f e c t e db ya g r o b a c t e r i u mt r m e f a c i e n s ， b u tr e s i s t a n ts h o o t sh a v en o tb e e no b t a i n e dy e tf o rl o w r e g e n e r a t i o nr a t e t h ee f f e c to f m a n n o s eo nc a l l u si n d u c t i o na n ds h o o tr e g e n e r a t i o nf r o ml e a v e so fs a n dp e a rw a s i n v e s t i g a t e d t h er e s u l ti m p l i e dt h a tm a n n o s ec a n n o tb e u i t i l i z e db yt h e s et h r e e c u l t i v a r s s op r e c o n d i t i o no fp m ir e s i s t a n ts y s t e mw a s p o s s e s s e d f o rt h ef i r s tt i m et h i sr e s e a r c hd e s c r i b e dt i m e c o u p ec h a n g e so fr e g e n e r a t i o n f r o ml e a v e so fs a n dp e a re x a m i n e du n d e r s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e i tc a nh e l p u s t ou n d e r s t a n dd y n a m i cc o u r s eo fo g a nd e v e l o p m e n t m o r p h o l o g i ci nd e t a i la n dg r o p e f o rb e s tw a y st oi n c r e a s er e g e n e r a t i o nf r e q u e n c y p r o g r e s so fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fp e a r t r e ei sd e t a i n e db y g r e a td i f f i c u l t i e s p a p e r so np e a rt r a n s f o r m a t i o ns t i l lh a v en o t b e e np u b l i s h e di nh o m e l a n d ，w h i l ea b r o a d af e w p a p e r s r e l a t e dw i t hp e a rt r a n s f o r m a t i o nw e r eo n l yl i m i t t e do nc u l t i v a ro fe u r o p e p e a ra n dp e ap e a r i nt h i ss t ud y ，t h ec o n d i t i o n so fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fs a n dp e a r w e r ei n v e s t i g a t e df i r s ta n do p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fa n t i b i o t i co nl e a v e so f c u i g u a n w a se s t a b l i s h e d t h i sm a yb er e f e r r e db yo t h e rc u l t i v a r so f p e a r 4 单位代码：研究生学号：2 0 2 1 6 0 3 5 砂梨组织培养及遗传转化研究论文评阅人： i 篷绍笠夔撞塞建委硒究员匿玉9 蓥副数援答辩委员会主席：谢鸣硒蕴虽答辩委员会委员：到丞童熬援墓慧媳副熬攮论文答辩日期： 2 q q 生壹目鱼目致谢值此论文完成之际，谨向我的导师柴明良副教授致以最真挚的感谢。本论文是在柴老师的悉心指导下完成的，从论文的设计、试验研究到论文的撰写，每一。个环节都凝聚着导师大量的心血。导师不仅是一位治学严谨，学识渊博的学者，更是一位和蔼可亲的长者。导师忘我的工作精神、对科学前沿的敏锐洞察以及宽厚包容的胸襟、正直善良的为人都给我留下了深刻的印象，使我深受裨益。三年来，导师指导我的学业，传授我做人的道理，关心我的生活，我的成长处处凝结着导师的心血，这些将激励我在科研道路】二不断奋发向上。真诚感谢园艺系贾惠娟副教授、滕元文教授、刘永立教授、徐昌杰副教授、陈昆松教授、郭延平副教授、陈力耕教授、张放教授在我三年的硕士学习阶段所给予的谆谆教诲和无私帮助。感谢园林所李芳老师的帮助和支持! 同时深深感谢严根洪老师的无私帮助! 师姐杨莉对实验给予了很多无私帮助和指导，使我的论文得以顺利完成，在此向她表示最衷心的感谢! 感谢王贺飞和候大强两位同学的热情相助，忘不r 在实验室和他们相处的点点滴滴。同一个实验室的郑慧俊、黄春辉、孔杨勇同学也给了相当大的帮助，在此向诸位表示衷心地感谢! 同时感谢许文平、胡桂兵、秦巧平、徐凯、吴延军、秦永华、尹涛、张波、张玉、杨绍兰、张岚岚、何新华、安1 仁明、于志浩、张望舒、鲍露、孙崇德、蔡冲、周春华、陈杨、戴正博士和毕静华、张晓萌、肖金平、王玉坤、刘辉、尹建华、姜新兵硕士，在我的学习、实验和生活中给予的帮助。感谢我的家人! 感谢所有支持过我、关心过我的亲人、朋友和同学! 感谢参加本论文评阅、答辩和对本论文提出宝贵建议的所有专家! 曹霞 2 0 0 5 年5 月_ 丁杭州缩略词表 a b b r e v i a t i o n s 英文全称 a c e t o s y r i n g o n e 6 - b e n z y l a a d e n i e c a r b e n i c i l l i n c e f t o m i n es o d i u m 2 ，4 - d i e h l o r op h e n o x y a c e f i ca c i d d a y s g i b e r u i ca c i d g e n t a m i n i n b g l u c u r o r i d a s e i n d o l ea c e t i ca c i d i n d o l eb u t a n o i ca c i d k a n a m y c i n l u x e m b o u r g m i n u t e s m u r a s h i g e a n ds k o o g n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d n e o m y e i n ep h o s p h o t r a n s f e r a s e f i f a m p i c i n r e v o l u t i o n s p e rm i n u t e t r a n s f e rd n a t h i d i a z u r o n d e g r e e c e l s i u s 中文名称乙酰丁香酮苄基嘌呤羧苄青霉素头胞噻肟钠 2 ，4 二氯苯氧乙酸天赤霉素硫酸庆大霉素 b 一葡糖苷酸酶吲哚乙酸吲哚丁酸专那霉素米一烛光分钟 m s 培养基萘乙酸新霉素磷酸转移酶利福平转数分转移d n a 三羟甲基氨基甲烷摄氏度燃腾雌叫啪。菩】 m 卧胁 m 柚 m m 删附呻一僦浙江大学倾十学位论文( 2 0 0 5 ) 第一章前言一文献综述梨( p y r u ss p p ) 是世界性的重要果树，在我国梨仅次于苹果和柑橘，为第三大果树，在二十多个省市均有分布。采用传统育种手段梨的许多性状已经得到了长足的改良，但现有的梨品种在遗传上对来自生物的和非生物的威胁以及对影响果实品质的生理病害存在着许多弱点。这些问题可通过栽培管理来缓解，但从根本上解决要靠育种和分子改良途径。与其它木奉果树一样，由于梨的高度杂合性以及童期较长的特点，使常规育种周期长。随着转基因技术的不断进展，缩短育种周期，并定向弓l 入有价值的外源基斟已经成为可能。 l 组织培养梨组织培养采用茎尖、腋芽、叶片、胚、胚乳、胚轴、子叶和原生质体等多种外植体，但以茎尖和叶片为多。 1 1 茎尖培养茎失培养的主要目的是脱病毒和快速繁殖。梨的病毒有2 0 余种，如苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒等，普遍危害梨树，导致产量和果实品质下降，甚至引起树体急剧衰退。提早梏死而致绝收。还可用茎失培养先期获得试管梢，再取其叶片作为转基因的受体材料。梨茎尖培养大多通过直接分化途径再生，仅c a b o n i l 2 1 从茎尖愈伤组织诱导出不定芽。 1 1 1 材料的采集和准备基因型不同，外植体增殖和形态分化显著不同。李昌珠等1 3 i 用西洋梨1 2 个基因型的茎尖为外植体，发现基因型间的差异明显，其中 “k o p o r e k a ”仅经过2 8 天便增殖5 6 倍：生根1 4 天后，生根率达8 8 6 5 ：而“v i l a ” 连续培养6 0 天，仅少量外植体形成愈伤组织，无芽和根的分化。此外，外植体的表现与取材母树的生理状态有关。芽萌动后的早期，树体贮藏营养比较充足，芽生长点处于活跃时期，茎尖容易存活；幼年树的茎尖较易培养，可能与幼树浙江大学硕士= 学位论文( 2 0 0 5 ) 酚类物质含量少，褐变较轻有关剞。也有研究表明“，取休眠枝条室内水培催芽，待萌动后剥取嫩芽，则污染率低于5 0 。 1 1 2 培养基茎失培养多以m s 培养基为基本培养基2 ，少数采用w p l l 3 ，“l 培养基和a s 培养基f 1 5 - 1 7 1 。李昌珠等3 1 比较了m s 和w p m 培养基，表明m s 更适宜于西洋梨。生根培养基则以i 2 m s l 6 7 j o 或a s h l l 5 - 1 7 1 为多。a m i r i l 9 1 发现，与固体培养相比，液体培养时往往培养体活力高，芽生长量大，生根能力强。其他研究也发现”3 在液体培养基中腋芽增殖快，但多数芽玻璃化；在固体培养基中虽然腋芽玻璃化症状减轻，但增殖慢；液固双重培养系统腋芽增殖快，且玻璃化症状少。琼脂浓度不仅影响芽的增殖和生长，还影响外植体对矿质元素的吸收。提高琼脂浓度时外植体对p 、f e 、z n 、a 1 吸收增加，而对c a 、m g 、 m n 的吸收减少i 。培养基的矿质元素浓度升高时，芽增殖和生长率都会提高，吸收的矿质元素总量也增加【9 i 。 1 1 3 培养条件一股采用1 6h 光周期，培养温度2 4 - 2 6 ，光照强度1 5 0 0 2 5 0 0 i x l 8 2 1 , 2 2 。w a n g 等1 2 2 i 发现，光电子通量( p p f ) 在1 0i _ t m o l m 2 s 8 0p m o h n 一2 s 一1 内逐渐升高，芽的数量、长度、鲜重以及干重均有所增加，在8 0p m o l m 。2 s 。时促进生根明显，而且先2 5 。c 暗培养4 7 天，有利于生根。另有报道，红光促进生根，远红光抑制生根1 2 3 1 。间苯三酚( p g ) 1 8 2 4 1 芹 i 活性炭也有促进生根的作用 1 1 5 1 。 1 1 4 植物生长物质刁i 同品种、不同外植体所适合的生长物质种类和浓度不同。影响芽生长与分化的生长物质有b a 1 2 1 3 2 1 i 、i b a l 9 洲、n a a l 2 9 1 等。b a 浓度过高芽簇化( f a s c i a t i o n ) 懿显，芽伟长受挪帛 j f f 5 - 2 2 5 ；添桶i b a 可减轻簇化症状1 2 引。c a b o n i l 2 1 发现玉米素在新生芽叶原基的纺锤形和扇形区细胞的积累，表明玉米素在梨体外器官发生的细胞分化中起主要作用。t d z 诱导再生芽增殖的效果优于b a ，但前者易引起芽的超度含水( h y p e r h y d r i c i t y ) ”。诱导不定芽生根的生长物质有i a a l l 2 1 、i b a 。2 2 3 2 6 1 、n a a 。i b a 促进生根效果好1 2 1 , 2 6 j ，但会导致根部形成愈伤组织，不利于移栽成活1 2 6 1 0 2 浙江大学硕j 二学位论文( 2 0 0 5 ) 1 2 叶片培养目前已有西洋梨( p y r u sc o m m u n i s ) 数个品种1 2 7 2 9 】，白梨( pb r e t s c h n e i d e r i i ) 1 2 7 1 砂梨( p p y r i f o l i a ) 3 0 1 ，野生梨( ps y r i c a ) 川叶片再生植株的报道。不定芽通常从叶片愈伤组织发生，但日本砂梨却不经愈伤组织而直接再生不定芽1 3 0 l 。 1 2 1 外植体的获得及处理一般取继代培养3 4 周的梨试管苗上部叶片，去叶柄后，垂直叶中脉划伤3 刀1 2 8 。3 3 i ，再接种。z h u 等j 3 3 仳较了两种损伤方法，即用解剖刀垂直叶中脉戈0 伤，或用镊子端部轻轻挤压叶片，使其处于易吸水状态。发现后者形成的愈伤组织多，再生频率高，再生芽也多。而日本砂梨品种 f 3 洲，受伤叶片的再生率低于完整叶片，可能是由于损伤改变了外植体内源激素的平衡或叶片再生的极性。也有梨叶柄再生不定芽的报道弘；。 1 2 2 培养基a b u q a o u d 等1 3 5 比较了n n 6 9 、1 2 m s 、m s 、l p 和w h 五种培养基，发现西洋梨叶片再生效果最好的是n n 6 9 ，其次是l t 2 m s ，最差是w h 。 “冀蜜”、“丰水”等梨品种叶片离体培养也表明n n 6 9 是一种适宜的培养基 3 6 - 3 8 1 。而c a b o n i 等i 雏1 在野生梨叶片再生中发现，l p 诱导芽效果较1 2 m s 好； l a i l e 等1 3 0 l i 删y j 日本砂梨品种叶片再生b 5 比m s 佳。z h u 等i ”1 研究了两种糖源对梨砧叶片再生的影响。发现“b p l 0 0 3 0 ”在添加蔗糖的培养基中再生频率高于添加山梨糖醇的培养基；而“o h f 3 3 3 ”的反应却刚相反。由此可见，基因型不同糖代谢的能力可能有所不同，所以不同基因型应选择不同的糖源。此外，基本培养基是影响叶片分化为不定稍还是体细胞胚的关键，孙清荣、3 93 等在n n 6 9 中诱导出了体细胞胚。 1 2 3 植物生长物质常用的生长素有n a a 1 2 7 , 2 8 3 3 1 i b a l 3 2 , 3 6 1 积i a a 【3 2 3 8 1 。 c h e v r e a u 等m 1 比较了n a a 、i b a 和2 ，4 d 诱导西洋梨叶片再生不定芽的效果，以n a a 最佳。不同的基因型最佳生长物质种类和浓度是不同的，因此转基因之前，进行预备实验，以得到某一基因型高再生率的生长物质组合是十分必要的。但高再生率的生长物质组合并不能一定保证有高转化率1 3 3 1 。诱导“c o n f e r e n c e ”高再生率的组合是2 7p , mn a a + 5 扯mt d z 而它获得高转化率的组合却是5 4 ：a m n a a + 9n m t d z l “。浙江大学硕上学位论文( 2 0 0 5 ) 1 2 。4 影响因素暗培养和接种方式一般暗培养2 0 3 0d 和远轴面接触培养基接种有利叶片不定芽的再生| 2 7 2 8 3 1 。3 3 剐。但l a n e 等0 3 0 1 发现暗培养和接触面对日本砂梨叶片再生无显著影响。取材部位一般试管苗顶部叶片幼嫩，离分生组织近，细胞分裂能力强，再生效率高1 2 8 m 3 3 一4 3 1 。但日本砂梨品种，最适外植体却是位于基部的较老叶片i 圳。氮化合物存在形式及n l l 4 + n 0 3 比率氮化合物在西洋梨叶片再生中起重要作用1 2 7 2 8 3 5 1 。一是铵离子含量。西洋梨在铵离子浓度高的n n 6 9 上再生率高，其次是m s 和l p ，而在几乎不含n h n n 0 3 的w h 中再生率接近零，若补充n h 4 n 0 3 到w h 中，再生率略上升。二二是n h 4 + 烈0 3 - 比率。不定芽的再生率随n h 4 + n 0 3 。比率而改变，当n h 4 讯0 3 - 比率为1 ，3 和1 2 时，无论总氮含量为多少，再生率最高1 2 8 3 5 1 。与西洋梨不同，降低n h 4 a e 浓度反而促进野生梨和日本砂梨叶片不定芽的再生3 ”，野生梨在n i l , + 浓度较低的l p 培养基( n h 4 + n 0 3 一比率为1 6 ) 不定芽的再生率最高。基因型基因型是影响再生率的关键因素之一。l e b l a y 等1 2 8 建市的西洋梨叶片再生体系中，平均再生率为3 2 6 6 个别品种可达6 0 9 7 。日奉砂梨再生率低于西洋梨，再生率最高的品种也仅2 2 i 。相同种不同品种间再生率也存在很大差异阿3 3 3 6 1 。抗生索和乙烯抑制剂头孢菌素对梨叶片再生不定芽有促进作用3 勤。乙烯抑制剂a g n 0 3 在o 1 1 5m e , l 时，对梨叶片再生不定芽也有促进作用| 3 2 3 4 4 0 m 。 1 3 源于其它外植体的离体培养原生质体是草本植物基因工程常用的转化受体，但梨原生质体培养仅有国外同组研究者的三篇报道1 4 4 舶1 ，国内未见有报道。还有研究以胚、下胚轴或子叶作为外植体1 4 7 j ”。1 9 3 4 年t u k e y 最早报道了西洋梨胚培养，并获得了完整植株0 5 叭。离体胚培养可克服杂种胚败育和种子体眠等。多数梨自交不亲和，遗传上高度杂合，范围大( 从常见的二倍体到六倍体均存在) ， 4 染色体小且基数大( x = 1 7 ) ，倍性给遗传改良带来严重障碍。通过花浙江火学硕上学位论文( 2 0 0 5 ) 药培养诱导单倍体，经染色体加倍后可迅速获得纯合材料，对育种、细胞学以及遗传学研究均有重要意义。k a d o t a 等0 5 2 1 报道了从花药i f 亍生的胚中诱导出不定芽。薛光荣等【5 3 在“锦丰”梨的花药培养上诱导出胚状体后，又分化出植株并移栽和嫁接成活。虽然梨的茎尖培养、叶片再生培养有了许多报道，但总体上繁殖系数低、再生频率低、而且结果不稳定，这与转基因操作所需的高效、稳定的再生体系仍有很大差距。并且，成功的报道大多集中在西洋梨上，而西洋梨与日本砂梨、中国白梨及砂梨之间遗传背景差异很大。所以从培养条件、植物生长物质的使用，到再生频率均有很大区别。在今后的研究中，应针对我国特定的种类直至主栽品种，进一步完善高效、稳定的再生体系，为梨树遗传转化奠定良好的基础。另值得注意的是，z h u 等在西洋梨砧木“b p l 0 0 3 0 ”叶片再生芽过程的扫描电子显微镜观察中发现，叶片所形成的分生组织的数量远远多于再生的芽数量1 3 3 1 ，我们在早熟梨主栽品种“翠冠”梨中也发现同样的情况( 待发表) 。如何通过改变生长物质的组合或浓度，或变更培养条件，促进更多的分生组织转化为形态正常的芽，有待研究。 2 遗传转化自1 9 9 3 年证实梨是根癌农杆菌的天然寄主后侧，1 9 9 6 年m o u r g u e s 等在西洋梨叶片再生体系建立m 1 的基础上，首次通过叶片与根癌农杆菌共培养将嵌合基因( n p t i i 和g u s ) 转入西洋梨，建立了西洋梨的遗传转化体系。1 9 9 8 年， m e r k u l o v 等1 5 5 1 用超毒力的根癌农杆菌菌株a 2 8 1 c 感染叶片将n p t i i 基因转入西洋梨，再生的不定芽表现出对卡那霉素的高抗性，并获得了转基因植株。上述研究为人们将重大经济价值的外源基因导入梨开辟了道路。 2 1 转入的外源基因类型和克隆的基因抗火疫病基因寄希望通过转基因技术提商两洋梨对火疫病的抗性，是至今为止报道最多的。火疫病是由坏死细菌e r w i n i a a m y l o v o r a 引起，是梨属植物，尤其是西洋梨的毁灭性病害。将源j 二禾谷类作物、昆虫以及微牛物的一些溶菌肽 ( c e c r o p i n ) 基因恻、s b 一3 7 m 5 “、s h i v a l t 5 、a t t a c i n 陬5 6 ，5 8 5 9 1 或源于t 4 抗菌素的浙江大学硕士学位论史( 2 0 0 5 ) 溶解酵素( 1 y s o z y m e ) 基因5 8 1 以及解聚酶( d e p o l y m e r a s e ) 基因【5 6 6 0 i 和乳铁传递蛋白( 1 a c t o f e r r i n ) 基因1 5 6 娜1 转入西洋梨中，以提高西洋梨对细菌性火疫病的抗性。r e y n o i r d 等5 9 1 在试管内对l l 株转a t t a c i ne 基因梨进行火疫病接种测试，有6 株症状明显减轻。p u t e r k a 等i 将合成的抗菌肽基因d 5 c 1 在启动子u b i q u i t i 控制下转入西洋梨中。发现转基因植株不仅对火疫病有一定的抗性，对梨木虱的危害也有一定的控制作用。m a l n o y 等| 6 2 1 还发现转牛乳铁传递蛋白( b o v i n e l a c t o f e r r i n ) 基因的多数转基因克隆，不仅对火疫病敏感性明显降低，而且对其它两种梨细菌病原体也有抗性。此外，为了提高抗火疫病基因的特异性表达，m a l n o y 等旧1 就烟草的启动子 h s i 一2 0 3 j 、s t i 一2 4 6 c 和s g d 2 4 在转基因梨中进行了研究。结果表明尽管s t i 一2 4 6 c 和s g d 2 4 的活性都低于c a m v 3 5 s ，但是病原反应能引起它们对驱动抗绌菌基因的特异性表达。矮化基因( r o l c 、r o m ) b e l l 等i “】将r o c 基因转入西洋梨。与对照植株相比，转化植株节间数减少，叶面积减小，呈现矮化症状。z h u 等1 3 3 1 将r o b 基因转入梨矮化砧，得到3 个转基因克隆的植株，其生根能力比对照强；他们进一步的研究表明1 6 5 i ，与对照植株相比，转基因植株不仅根系量多而且分布均匀，同时部分克隆节间缩短，植株矮化。乙烯合成相关基因g a o 等1 6 6 1 从西洋梨品种l af r a n c e 成熟果实中克隆了a c c 合成酶和a c c 氧化酶基因，并将其反义转入同一品种，分子分析表明转基因克隆中a c c 氧化酶表达被抑制，乙烯生成减少。品质楣关基因i 上b c d e v 等旧l 将超甜蛋白t h a n m a t i n u 基因转入西洋梨，免疫e b 迹( i m m u n o b l o t ) 检测发现在叶片中t h a u m a t i n l l 蛋白占总蛋白的0 2 5 。植物防卫基因l e b e d e v 等1 6 8 将从萝h 中克隆出的植物防卫基因( p l a n t d e f e n s i v eg e n e s ) r s a f p 2 ，转入西洋梨b u r a k o v k a 中，转化频率为l l 一5 9 ，得到7 0 个转化克隆。抗除草剂基因b a r 基因编码的p p t 乙酰转移酶能使除草剂p p t 乙酰化，失去毒力。l e b e d e v 【6 9 1 等将b a r 基冈转入砧木g p 2 1 7 中，转化频率为0 9 51 。得到的多数转化植株在含2 5 0m g 几p p t 的增殖培养基中生长良好，而对照在含2 m g lp p t 培养基中死广。 6 浙江大学倾+ 学位论立( 2 0 0 5 ) 由于梨树生长期较长，以上转基因植株成年树的表现尚未见后续报道。克隆的基因随着植物基因组计划的进展，借鉴在拟南芥等模式植物的研究，近年来从梨中分离功能基因也逐渐开展，目前在g e n b a n k 中登记的梨基因主要涉及了与乙烯、黄酮类及糖等代谢以及果实成熟、自交不亲和等生理过程相关的基因( 表1 ) 。但尚需要对这些基因功能进行研究，了解其表达特性。表1 从梨中分离的重要基因 t a b l e1i m p o r t a n t g e n e s i s o l a t e df r o mp e a r 浙江大学硕上学位论文( 2 0 0 5 ) 接上表： 2 2 外植体常用叶片做外植体。但l e b e d e v 等1 6 7 1 用叶柄做外植体，将b a r 基因和n p t i i 基因转入两洋梨，且转化率高于叶片。k a n e y o s h i 等1 7 0 1 用根癌农杆菌感染子叶，将g u s 基因和n p t l l 基因转入豆梨( pb e t u l a e f o l i a ) 。 2 3 检测方法梨的转化子主要采用g u s 活性检测、p c r 检测和分子杂交检测。半定量 r t - p c r t 5 4 5 6 , 5 7 , 5 9 , 6 0 1 也是常用的检测方法。此外m e r k u l o v 等1 5 5 1 用纸层析法证明了 n p t i i 在梨组织中的活性。还可以针对外源罚的基因的功能对转基因植株进行直接检测。 2 4 影响遗传转化的因素多种因素影响农杆菌介导的梨遗传转化。首先，梨种类和品种不同3 3 , 4 2 1 、所用转化外植体类型和发育阶段不同，则农杆菌感染力、植株再生能力、生根能力以及转化率均不同。其次，所用农杆菌株不同，则植株再生能力和转化率浙江大学硕上学位论文( 2 0 0 5 ) 不同。k a n e y o s h i 等7 0 1 比较了6 种农杆菌菌株对豆梨子叶的感染能力，表明 a k e l 0 感染力最强，它既能形成愈伤组织，又能诱导出不定芽，甚至以低频率诱导出不定根。其它菌株只能形成愈伤组织，而p 0 2 2 的感染能力最差，甚至无愈伤组织形成。再次，标记基因不同也会影响转化率。l e b e d e v 等1 6 7 川比较了用n p t l i 或忉r 作选择性标记基因的转化频率，发现用n p t i 转化频率为0 4 3 1 ，低于用h m 作选择标记( 转化频率达6 2 1 1 5 ) ，且用潮霉素筛选时，假性转基因( p s e u d o t r a n s g e n i c ) 再生体比例下降。此外，外源基因编码区中插入内含子会影响转基因在植物组织中的表达效率及其表达的稳定性。l e b e d e v 等1 6 7 , 7 1 1 发现，用插入内含子的g u s 基因转化外植体，荧光检测其g u s 基因在植物组织中表达活性是不含内含予g u s 基因转化的三倍，且连续几年的表达水平相当稳定。最后，共培养时间的长短也会影响转化率。m o u r g u e s 等发现，g u s 阳性斑块的数量随共培养时间延长而增加，至4 - 6 天时达最多。 2 5 问题与展望尽管梨转基因研究取得了一定成绩但还存在许多问题。第一，转化频率普遍很低。例如，z h u 等f 3 3 在西洋梨砧木转化的预备试验中，在3 5 0 0 张感染的叶片中没有得到再生植株，尽管在随后的试验中方法得到了改进，但在感染的 2 0 0 0 张叶片中也仅得到3 个转化克隆。第二，现得到的转基因梨多为西洋梨及其砧木类型，其它栽培种类的梨未见有报道。第三，目前导入梨的基因大多是一些抗菌肽基因，其中只有一例报道采用的是病原诱导的启动了1 6 引，其它均为结构陛表达的启动子。后者除易引起依赖于同源性( h o m o l o g y d e p e n d e n t ) 的基冈沉默外，转基因蛋白，如抗菌蛋白在果实中的积累，也对消费者的健康存在潜在的危害。此外，许多与果实产量和品质等熏要性状相关的基因的遗传转化研究尚未开展。鉴于以上存在的问题，我们认为未来梨遗传转化研究的重点应集中在以下几个方面： 1 在建立的稳定、高效的再生体系的基础上进一步优化转化体系，并扩大品种研究范围，特别是对砂梨品种研究。 2 积极探索新的转基因筛选体系一种可在植物转基因中应用的新型筛选方法磷酸甘露糖异构酶( p m i ) 法，它以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛 q 浙江大学硕士学位论史( 2 0 0 5 ) 选。p m i 能将甘露糖6 磷酸转化成果糖6 一磷酸，使转化细胞能以甘露糖为唯一或主要碳源而正常生长；非转化细胞由于不能利用甘露糖而生长停止。安全评估表明p m i 基因对人体健康和环境无害。我们目前正在开展p m i 基因转化砂梨的研究，业已发现砂梨不能利用甘露糖，因而具备应用该筛选体系的前提条件。 3 与果实产量和品质等重要性状相关的基因的克隆和遗传转化有待加强。二本论文的立论依据现有的砂梨品种存在很多不足之处。首先对霜害的抗性差，江、浙、闽沿海一带常因“倒春寒”( 早春天气回暖之后骤然降温) 而发生冻花冻芽现象。开花期及幼果期遇到霜冻，花托或幼果的表皮纽| 胞及其下组织受害后会产生大片锈斑或霜环。