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细胞遗传学实验技术标准操作规程SOP.doc

花匠小妙招
2025-02-26 02:09

细胞遗传学实验技术标准操作规程SOP

细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）外周血培养及染色体的识别1 白血病骨髓及外周血染色体5 外周血细胞脆性位点检测技术7 人羊水细胞培养收获操作程序7 绒毛细胞培养和染色体分析9 高分辨染色体操作方法和识别10 GII式显带法13 N式显带法13 R(反式)显带法13 姐妹染色单体互换（SCE）技术13 荧光原位杂交操作程序14 附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP）18 天平称量操作规程18 药匙处理操作规程18 PBS配制规程18 胰酶配制规程19 培养基配制规程19 1N HCL 配制规程19 1N NaOH配制规程20 外周血培养及染色体的识别 1. 原理：外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素处理就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察与分析。 2. 外周血培养与收获操作步骤： 2.1 采血：用20:1肝素（0.4%）温润无菌注射器抽取外周血5ml（注意：消毒时需脱碘）。 2.2. 种血：将注射器搓捏，使血样混匀，在无菌条件下，用7号针头垂直种血0.3ml±抗凝血（成年男子28滴，成年女子30滴左右，儿童32滴）至外周血培养基内。 2.3. 培养：将培养瓶放入37℃恒温箱中培养68-72小时，注意第二观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象，可每天培养液摇一摇，以便细胞可获得充分的营养，但一般情况下可不摇。 2.4. 制片过程： 2.4.1. 加秋水仙素：在培养完成前2-3小时，加入浓度为20ug/ml的秋水仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3小时。 2.4.2. 离心：将培养液用吸管吸至离心管中（100ml离心管）2000转/分×10分钟（Beckman离心机）。 2.4.3. 低渗液处理：弃上清，加入已预温至37℃的0.075mol/L氯化钾溶液约6-8ml，用吸管充分打匀，放入37℃水浴箱中，温育30分钟。 2.4.4. 预固定：即在离心管中加入现配的预温至37℃的甲醇、冰醋酸固定液（3:1）1ml左右，轻轻混匀。 2.4.5. 再次离心：2000转/分×10分钟。 2.4.6. 第一次固定：弃上清，加入现配的预温至37℃的新配固定液约6-8ml，轻轻混匀，然后2000转/分离心10分钟。 2.4.7. 第二次固定与第一次固定相同。 2.4.8. 制片：弃上清，用固定液将沉淀调成细胞悬液（一般不宜太浓）在冰片上滴片，一般高度为30cm±，每张片上滴2滴。烤片： 2.5. 显带：先将玻片放在预温至37℃的0.025%胰酶溶液中（PH=7.2-7.4）消化1’30”左右，每次的作用时间并不完全相同。可先试一张片子，再根据显带效果调整胰酶作用时间，再放在预温至37℃的0.85%NaCl溶液中漂洗两次，在预温至37℃的Giemsa溶液中染色10分钟，自来水冲洗干净，用吹风机吹干后，即可阅片。 3. 各号染色体的识别：各号染色体的界标和带型特征 A组染色体：包括1~3号染色体，其长度最长的1号和3号染色体的着丝粒约在1/2处，2号染色体的着丝粒约在3/8处。 1号染色体：着丝粒和次缢痕染色深。短臂——近侧段和中段各有一条深带，其中段深带稍宽，在处理较好的标本上，远侧段可显出3～4条淡染的深带。此臂分为3区，近侧的深带为2区1号带，中段深带为3区1号带。长臂——次缢痕紧贴着丝粒，染色浓。其远侧为一宽的浅带，中段和远侧段各有两条深带，以中段第2深带染色较浓，中段两条深带稍靠近。此臂分为4个区，次缢痕远侧的浅带为2区1号带，中段第二深带为3区1号带，远侧段第三深带为4区1号带。 2号染色体：短臂——可见4条深带，中等的两条深带稍靠近。此臂分为两个区，中段第2、3深带之间的浅带为2区1号带，长臂——可见6~7条深带，此臂分为3个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1号带，第4和第5深带之间为3区1号带。 3号染色体：着丝粒染色浓。在短臂和长臂的中段各有一条明显宽阔的浅带，是该染色体的特征。短臂——一般在近侧段可见两条深带，远侧段可见3条深带，其中远侧段近端部的一条较窄，且着色较淡，这是区别3号染色体短臂的显著特征。此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带。长臂——一般在近侧段和远侧段各有一条较宽的深带。在处理较好的标本上，远侧段的深带可分为三条深带，此臂分为两个区，中段浅带为2区1号带。 B组染色体： 4号染色体：短臂——可见一条深带，短臂只有一个区。长臂——可见均匀分布的四条深带，在处理比较好的标本上，在第2、3深带之