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杜鹃花类菌根真菌与菌根辅助细菌互作协同促进蓝莓生长机制研究

花匠小妙招
2025-03-16 02:09

越橘属(Vaccinium)植物种类繁多,其中一些蓝果种类被称作蓝莓。蓝莓根系呈纤维状,没有根毛,在自然条件下生长缓慢。为有效地从土壤中获取养分及水分,蓝莓进化成多种适应性策略,其中最主要的是与杜鹃花类菌根真菌形成杜鹃花类菌根(Ericoid mycorrhiza,ERM),其可促进蓝莓养分吸收。近年来对菌根共生体的研究结果表明,菌根真菌-植物共生体与根际微生物有着紧密的相互作用,其中部分细菌类群在促进菌根合成和植物生长方面发挥了重要作用,这些细菌被称为菌根辅助细菌(Mycorrhizal helper bacteria,MHB)。MHB能促进菌根真菌孢子萌发、菌丝生长、提高菌根真菌的侵染率,从而间接促进植物的生长。目前对于丛枝菌根和外生菌根的MHB相关报道较多,杜鹃花类菌根MHB鲜有报道。本实验室前期已分离到了杜鹃花类菌根真菌树粉孢菌(Oidiodendron maius)143和MHB巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)B40;O.maius 143可以专性和蓝莓建立共生关系,并促进植物氮素、磷素吸收以及生物量的增加,而B.megaterium B40可以显著促进O.maius 143的生长。基于此,本研究以蓝莓-O.maius 143共生体系为研究对象,分别探究单独以及混合接种调控植物-微生物互作的规律及其中的机制。主要研究结果如下:(1)利用根盒隔网分室培养体系探究O.maius 143和B.megaterium B40单独以及混合接种对蓝莓生长及生理水平的影响。结果表明:混合接种促进了蓝莓生长,促进蓝莓叶片C、N、K、Ca、Mg、Fe、Zn和Mn营养元素的吸收积累;且混合接种提高了叶片硝酸还原酶(NR)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)和酸性磷酸酶(ACP)活性。根系形态学分析结果表明:混合接种显著提高了蓝莓根长、总根表面积、总根体积、根尖数、分支数以及交叉数,扩大了根系的吸收面积,提高了蓝莓根系活力。外源添加B.megaterium B40,提高了土壤中O.maius 143的菌丝密度、菌根依赖性以及菌根定殖率;菌根定殖率由40.67%提升至71.67%。O.maius 143和B.megaterium B40接种促进了蓝莓叶片中脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加;伴随着H_2O_2和NO含量的积累,表明接种处理会增强蓝莓的氧化响应。混合接种提高了蓝莓根部水杨酸和茉莉酸含量;也提高了过氧化物酶、超氧化物歧化酶以及过氧化氢酶活性,降低了丙二醛含量,减轻蓝莓的氧化胁迫损伤。(2)O.maius 143和B.megaterium B40混合接种也可以促进蓝莓叶片光合色素的积累,同时提高植物的光合速率与光合性能;促进了地上及地下非结构性碳水化合物(还原糖、蔗糖和淀粉)的积累,更多的碳水化合物被转移到根和根系分泌物中;同时也促进更多的小分子碳水化合物(可溶性糖、还原糖和氨基酸)在根系分泌物中积累。体外实验验证了O.maius 143和B.megaterium B40混合接种后,根系提取物及根系分泌物可显著促进菌根真菌生长。以上结果说明,O.maius 143和B.megaterium B40混合接种促进了蓝莓初级碳代谢,并诱导碳水化合物从源到库的分配过程,有利于维持共生互作体系的稳定性。(3)土壤理化性质及酶活性是评估土壤健康情况的重要指标。本研究通过O.maius143和B.megaterium B40单独以及混合接种,分析其对蓝莓土壤理化指标、酶活性以及招募微生物情况的影响。结果表明:单独接种及混合接种对蓝莓根际土壤的有机碳(SOC)、总碳(TC)、总氮(TN)、速效磷(AP)、全磷(TP)以及碳氮磷代谢相关的十种土壤酶活性均有不同程度的促进作用;其中,混合接种促进效果最为显著。高通量测序结果表明:单接种ERM真菌以及混合接种均显著提高了蓝莓根际土壤细菌α多样性、提高蓝莓根际土壤真菌群落的ACE、Chao1指数。NMDS分析表明:单独接种及混合接种使蓝莓根际土著微生物群落发生变化,不同接种处理间根际土壤性质及菌群结构差异明显。单独接种及混合接种后蓝莓根际细菌、真菌群落组成及丰度变化明显。各处理中,Firmicutes和Bacillus在混合接种处理中相对丰度最高,Proteobacteria和Burkholderia在单接种ERM真菌处理中相对丰度最高。Basidiomycota在混合接种处理中相对丰度最高,Mortierellomycota、Penicillium和Mortierella在单接种ERM真菌处理中相对丰度最高。Lefse分析表明,单独接种和混合接种改变了土壤微生物中的一些关键物种。土壤环境因素与土壤细菌和真菌群落之间关系密切,TC、p H、TN和AP是影响蓝莓根际细菌群落的关键环境因子,p H是影响蓝莓根际真菌群落的关键环境因子。(4)采用体外摇瓶发酵培养体系进一步研究O.maius 143与B.megaterium B40的互作机制。B.megaterium B40的胞外代谢产物可显著促进O.maius 143菌丝的径向生长及菌丝干重。同时,外源添加B.megaterium B40发酵产物,影响了O.maius 143菌丝的内源性激素含量,提高了O.maius 143产孢能力、细胞壁降解酶活性以及共生相关基因的表达,促进了蓝莓与O.maius 143的识别过程。收集并测定B.megaterium B40胞外代谢产物,主要包括羧酸及其衍生物、脂肪酰基以及有机氧化合物。由于部分腐生菌根真菌是维生素缺陷型,为进一步挖掘B.megaterium B40促进O.maius 143生长的信号分子,选用烟酸(VB2)、甜菜碱(VB4)、泛酸(VB5)以及肌醇(VB8)4种维生素和香豆素及其衍生物(七叶树素和香柠檬烯)共6种物质作为候选信号分子进行后续试验。结果表明:B.megaterium B40分泌的烟酸(VB2)在浓度为10μM和50μM时,可以显著促进O.maius 143的生长,被定义为细菌促进菌根真菌生长的信号分子。利用无菌分隔培养体系,收集O.maius 143菌丝分泌物,其可以显著促进B.megaterium B40的生长及生物膜的形成,提高B.megaterium B40胞外多糖含量;同时,也提高了B.megaterium B40运动能力,促进其在菌根真菌菌丝表面的定殖。收集并测定O.maius 143菌丝分泌物,其中包含大量的糖类、氨基酸以及有机酸类物质。从菌丝分泌物中选取相对表达含量较高的糖类(蔗糖、果糖和阿拉伯糖)、有机酸(琥珀酸、水杨酸和α-酮戊二酸)、氨基酸(丙氨酸、脯氨酸和半胱氨酸)以及黄酮共10种物质进行细菌趋向性实验。结果表明:果糖对B.megaterium B40的趋化效果最佳,进一步解析了O.maius 143促进B.megaterium B40生长的机制。本论文系统地研究了O.maius 143与B.megaterium B40互作协同促进蓝莓生长机理,提高了对ERM真菌的生态功能及菌丝际微生物相互作用的认识,为制备菌根真菌-菌根辅助细菌混合菌剂、开发蓝莓生物肥料打下基础。以期通过科学、合理、充分地利用蓝莓根际微生物,生态调控杜鹃花类菌根真菌的定殖,促进苗木菌根化进程,提高蓝莓生产力。