首页 > 分享 > 《第七章植物病毒》课件.ppt

《第七章植物病毒》课件.ppt

花匠小妙招
2024-09-17 16:38

免疫学方法在病毒检测中应用最广泛的有：组织印迹法在ELISA的基础上发展起来的植物病毒检测技术保持ELISA对病毒检测的灵敏度高、特异性强的特点，而且大大地简化了操作程序，对病毒的检测更加快速、简单、方便。印迹在硝酸纤维膜上的样品能保存3个月以上，检测结果能直观地显示出病毒感染的部位。尤其适用于植物病毒的大规模普查，是近年来国外对植物病毒检测广泛采用的技术。植物病毒的检测——组织印迹法 1、基本原理与间接ELISA相同，首先将待测样品印迹在固相载体——NC上，用病毒的家兔特异性抗体(Ig)与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与碱式磷酸酶(Alkaline phosphatase AP)标记的第二抗体（羊抗兔Fc）进行反应，最后用碱式磷酸酶的反应底物BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/ nitro blue tetrazolium)进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。植物病毒的检测——组织印迹法具体反应：碱式磷酸酶（AP）以硝基酚磷酸盐为底物，在pH9.5条件下产生不溶性蓝色。 (辣根过氧化物酶HRP是以H2O2为底物,需要供氢体如四甲基联苯胺(TMB)参与，在pH5.0条件下产生可溶性黄色产物，需借助比色分析.) 植物病毒的检测——组织印迹法植物病毒的检测——组织印迹法基本步骤 1、采样 3、封闭 2、点样 4、洗涤 5、病毒与特异抗体反应 6、洗涤 7、第二抗体连接反应 8、洗涤 9、显色反应 10、终止显色 11、干燥保存采取植物叶、茎根等，避免手与样品伤口接触，装入塑料袋。将NC膜置于平整洁净滤纸上，用手术刀片横切样品，将切口均匀压印在膜上，印迹清晰为宜，每张膜上可排列数百个样品，设正负对照。将点好样的膜置于盛有2％脱脂奶粉的PBS封闭液的培养皿中，封闭液的用量以覆盖膜为宜．在37℃下温浴 lh或 4 ℃过夜用PBS-Tbuffer洗膜3次，5min/次将清洗后的膜转入含有特异性抗体的封闭液或PBS缓冲液的培养皿中，37℃下温育3h或4℃过夜 7 洗毕，将膜转入含碱式磷酸酶标记的羊抗兔第二抗体的PBS缓冲液中，37℃下温育3h或4℃过夜 9 将NC膜转入显色液中直至阳性对照显色为止（5~10min） 10 待阳性对照显示清晰的紫蓝色时，将膜转入蒸馏水中．终止反应终止反应后．将膜放置于干净的卫生纸之间，使之干燥，待完全干燥后过塑，便永久保存和观察植物病毒的检测——组织印迹法的灵敏度一次切割，连印45次（蕙兰花叶病毒）感病叶汁液稀释1：100 000，均呈+ 灵敏度可达20pg/ml (1pg=1×10-12g) 较ELISA方法灵敏2～3个反应级免疫学方法受到的限制 ① 检测病毒的基础是利用病毒外壳蛋白的抗原性,但有些植物病毒在某些情况下缺乏外壳蛋白,而类病毒则没有外壳蛋白; ② 季节性的不确定变化问题常阻碍+与-样品的区分:如ELISA可以检测出藜属的叶、花、果实中的CMLV,但对于休眠植物的木本部分却难以成功; ③ 病毒在感染植株上不均匀分布，病毒分离物的多样性也给ELISA法带来了问题，从苹果、樱桃、梨上分别取样检测ACLSV的存在，只有花瓣是可行的，因此准确鉴定局限于每个生长期的2周时间; ④ CMLV与PMV可以侵染相似的寄主，然而导致不同的病症,并且两者在血清学上相关，用ELISA不易检测。病毒检测的分子生物学技术灵敏度高、特异性强、检测速度更快、操作简便、可用于大量样品的检测。可以从植物体的任何部分取样检测,很容易区分病毒，甚至病毒的不同株系或分离物。应用组织印迹杂交技术检测蕙兰花叶病毒(CyMV)和齿瓣兰环斑病毒(ORSV) ,其灵敏度可达20pg/ml[1pg(皮克)= 1×10-12 g] 分子生物学检测法是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在。此方法比血清学方法的灵敏度高,能检测到pg级甚至fg级[1fg(飞克)=1×10-15g]的病毒. 1、核酸序列分析技术 2、dsRNA电泳技术 3、PCR技术 4、限制性内切图谱 5、分子标记技术:AFLP、RFLP、RAPD 病毒检测的分子生物学技术病毒检测的分子生物学技术 1、核酸分子杂交技术杂交的双方是使用的探针和要检测的核酸。待测核酸——克隆的基因片段、未克隆化的基因组DNA、病毒总RNA。被检测核酸——提纯 (膜上印迹杂交或液相杂交), 在细胞内杂交(细胞原位杂交)。所用探针必须标记,以便示踪和检测。最初用放射性同位素(如32Ｐ)标记探针;但不利常规检测,且探针寿命短。非放射性探针分子,如生物素或地高辛标记的探针分子特定基因标记 2、双链RNA(dsRNA)电泳技术原理：ssR