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一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用专利检索

花匠小妙招
2024-09-17 19:34

说明书全文

一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用。

背景技术

[0002] 油菜花叶病毒 (youcai mosaic virus, YoMV) 最早于1958年在中国油菜上发现 (魏景超等, 1958)，可以侵染包括十字花科、百合水仙科、菊科、凤仙花科、龙胆科、茄科等多种植物 (Ju et al., 2019)，目前已经在中国、韩国、日本、德国、瑞士、西班牙、英国等多国报道，对十字花科作物和园艺作物生产造成了严重危害 (Zhu et al.，2001；Kwon et al.，2018；刘勇等，2019)。

[0003] YoMV属于烟草花叶病毒属，极易通过种子带毒及机械摩擦传播。YoMV编码四个蛋白，分别为125 kDa的复制相关蛋白、182 kDa的复制酶、30 kDa的运动蛋白、17.7 kDa的外壳蛋白。虽然YoMV可以侵染众多十字花科植物，但关于YoMV在萝卜上的发生报道却很少，国内目前暂无报道。YoMV不同株系侵染性差别较大，国内虽然有YoMV株系及其全长序列报道，但是并无侵染性克隆报道，对YoMV的研究还仅仅局限在利用保存的病样进行摩擦接种，比较费时费力，而且还不能保证病样的纯化效果。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是为筛选抗性品种及对油菜花叶病毒致病机制的研究提供一种新选择。

[0005] 本发明的技术方案是一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体，该载体来自于菌株Agrobacterium tumefaciens YoMV‑GD，保藏号为GDMCC No.62229。

[0006] 进一步的，所述载体上的表达原件中油菜花叶病毒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

[0007] 本发明还提供了所述载体在筛选抗油菜花叶病毒的植物中的用途。

[0008] 进一步的，所述的植物为烟草、油菜、白菜、菜心或萝卜。

[0009] 本发明还提供了所载体的构建方法，包括如下步骤，以SEQ ID No.7所示核苷酸为模板，设计两对引物扩增出SEQ ID No.7所示核苷酸的前半段和后半段，然后通过同源重组技术，将扩增的前半段和后半段通过同源重组的方法直接连接到pCB301载体上。

[0010] 进一步的，所述前半段的引物如SEQ ID No.3 和SEQ ID No.4所示。

[0011] 具体的，所述后半段的引物如SEQ ID No.5 和SEQ ID No.6所示。

[0012] 本发明的有益效果：本发明从野外采集到一株新的病毒株系，并将其全长核苷酸序列构建到pCB301载体上，获得油菜花叶病毒侵染性克隆载体，将该载体转化农杆菌，即可利用农杆菌注射方法来接种油菜花叶病毒，为筛选油菜花叶病毒抗性材料和品种以及研究油菜花叶病毒基因组结构、致病性以及与寄主之间的互作奠定了基础。附图说明

[0013] 图1、田间采集到的疑似染病样本。

[0014] 图2、三个疑似样本的PCR产物的电泳结果；M，DNA marker；1～3泳道代表从田间采集的三个不同样品的扩增结果；CK，无症状植株对照。

[0015] 图3、全序列克隆过程的PCR产物的电泳结果；M，DNA marker；1～3泳道代表前半段序列PCR扩增结果；4～6代表后半段序列扩增结果。

[0016] 图4、YoMV‑GD株系侵染性克隆载体示意图；oriV，复制起始位点；LB T‑DNA repeat，农杆菌插入左臂；RB T‑DNA repeat，农杆菌插入右臂；NOS terminator，NOS终止子；KanR，卡那霉素抗性基因；trfA，复制激活作用元件；CaMV 35S promoter，来源于CaMV的35S启动子。

[0017] 图5、农杆菌感染烟草后的图片；Mock，接种包含空载体的农杆菌对照植株；YoMV，接种YoMV‑GD的植株。

[0018] 图6 、农杆菌注射接种萝卜和菜心发病图片。

[0019] A：萝卜发病图片。Mock，接种包含空载体的农杆菌对照植株。LB‑1，接种YoMV‑GD的萝卜品种1。LB‑2，YoMV‑GD的萝卜品种2。LB‑3，YoMV‑GD的萝卜品种3。

[0020] B：菜心发病图片。Mock，接种包含空载体的农杆菌对照植株。CX‑1，YoMV‑GD的菜心品种1。CX‑2，YoMV‑GD的菜心品种2。

[0021] C：RT‑PCR检测图；M，DNA marker；1泳道代表接种包含空载体的农杆菌对照萝卜样品；2泳道代表阴性对照；3～5泳道代表接种YoMV‑GD的萝卜品种1、萝卜品种2和萝卜品种3：6泳道代表接种包含空载体的农杆菌对照菜心样品；7泳道代表阴性对照；8和9泳道代表接种YoMV‑GD的菜心品种1和菜心品种2。

具体实施方式

[0022] 实施例1 病毒的克隆以及载体的构建从田间采集疑似感染YoMV的三个萝卜病样，症状为黄化、花叶、植株矮小等症状 (图1)。

[0023] 提取总 R N A ，根据已知病毒序列的保守区域设计引物：F :aatatcagagagcggcattctat（SEQ ID No.1），R:ctgtcggtaaaagtgcaatataact（SEQ ID No.2），RT‑PCR检测，结果发现样品3可以检测到目的条带 (图2)，样品1、2和无症状CK对照则未扩出条带 (图2)，说明样品3感染了YoMV。

[0024] 以样品3的cDNA为模板，将YoMV全长分为两段，设计引物扩增YoMV全长序列。前半段引物：F1:aagttcatttcatttggagagggttttatttttattgcaacaacaacaa（SEQ ID No.3），R1:tgaacactgtgtcgatctgtaattgctattgggtccccga（SEQ ID No.4）；后半段引物：F2:aacagcgactcccttggagatcatatcaagagcgtcacctcatg（SEQ ID No.5），R2: ggtggagatgccatgccgacccttgggcccctacccggggtta（SEQ ID No.6）。PCR结果显示可以扩出目的条带，前半段3400 bp左右，后半段3100 bp左右 (图3)。将前后半段的PCR产物通过同源重组的方法直接连接到pCB301载体 (姚敏等，农杆菌介导的 CMV 侵染性克隆及 2b 缺失突变体构建，中国农业科学，2011) 上，获得YoMV侵染性克隆并测序得到YoMV全长序列，通过NCBI Blast及DNAMAN软件比对发现获得的YoMV序列与数据库中的YoMV序列均不一致，所以判定从田间采集的毒株为获得的是新的YoMV株系。

[0025] SEQ ID No.7 YoMV全长序列：gttttatttttattgcaacaacaacaacaaattacaataacaacaaaacaaatacaaacaacaacaacatggcacaatttcaacaaacagtaaacatgcaaacattgcaggctgccgcagggcgcaacagcctggtgaatgatttagcctcacgtcgtgtttatgacaatgctgtcgaggagctaaatgcacgctcgagacgccctaaggtccatttctccaaatcagtgtctacggaacagacgctgttagcttcaaacgcttatccggagtttgagatttcctttactcatacccaacatgccgtgcactcccttgcgggcggcctaaggactcttgagttggagtatctcatgatgcaagttccgttcggttctctaacgtacgacatcggtggtaactttgcagcgcaccttttcaaaggacgcgattacgttcactgctgtatgccaaacttggatgtacgcgatatagctcgtcatgaagggcacaaggaagcgatcttcagttacctttctcgcctagataggcagaagcgaccagtccccgaatatcagagagcggcattctataactacgcggagaatcctcatttcgttcactgtgaccgaccatttcagcagtgtgagctaagcaccgttaacggtgcggacacttacgctattgcacttcatagtatatatgatattcctgctgatgagtttggtgcagcgctactcaggaagaatgtgaaaatttgttacgcggctttccatttccacgaaaatatgctccttgactgcgactctgtcacactggaggacattggagccgcatttcaacgcgccggtgacaagttgaatttcttcttccacaacgagagcacactcaattacacccatagttttagtaatataattaagtatgtgtgtaagaccttctttcctgcgagtcagcgttatgtgtatcataaggagtttttagttactagagttaatacgtggtattgtaagtttactagagtcgatacttttactcttttccgtggtgtgtacagaacaagtgtggatagcgaggagttctacaaggctatggatgacgcgtgggaatacaagaagaccttggctatgctaaattccgagaggaccatcttcaaggacagtgctgccatgaatttctggtttccaaaggtcagagatatggtcatcatacctctctttgacgcatctatcacaactggaaggatgtctagaagggaagtgttggtgaacaaggattttgtttacacagtccttaaccacataaaaacctatcaagcaaaggccttaacatatgctaatgtgttatctttcgttgagtctattaggtctagagttatacttaacggtgtcactgccaggtcggaatgggataccgacaaggcaatcttaggtccgttagccatgacatttttccttgtcacaaagttgagtcatgttcaggacgagatcgtccttaagaagttccaaaagtttgacgccactgccaaagaactgatttggtcaagtctctgcgatgccctgaagggggttataccctcggtcaaggagactctcgcgcgcggtggtttcgttaagcttgctgaagagagtttagagatcaaaattccggagttatattgcacttttaccgacaggttagtgcttgaatataagaggacagaggagtttcagtcgtgtgatctgtccaaacctttggaagagtctgagaagtactataatgcgttatccgagctgtctgtgcttgaaaatcttgactcgtttgatctggatgcctttaaggagttgtgtcaaaagaagaacgtcgaccctgatgtcgctgcgaaggtggtggtggcgattatgaatagtgaattgacgttgccgttcaagaaacctacagaagaggaagttgctgaggcgcttagcggagaagtggtgcaggatgaaggattgagtctgagtaacaacgcacccttcccatgtgtgagtaacctcaaggagggtttggttccggcgtgtggattgggtccgaaaggtgcgaacttcgacagagtggatatggacatatctgagttccatctcaagagtgtagatgcagttaaaaaaggggctatgatgtcagcggtgtacacgggaaagatcaaggttcaacagatgaagaactacgtcgattacctaagtgcctcattgtcagctacggtctcaaacctctgtaaagtgcttagggatgttcacggagttgaccctgaatctcaagagaagtcgggtgtgtgggacgtgagaagaggacgctggttactaaaacctaacgcgaagtgtcacgcttggggtgttgcggaagatgctaaccacaagttagttatcgtgttacttaactgggatgaagggaaacctgtctgtgatgagacgtggtttagattggcagtttctagcgactcattggtgtactctgatatgggtaaactcaagacgttaacggcatgttgcagagatggtgagcctccggagcctacggccaaagtggtactcgttgacggtgttccgggctgcggaaaaacaaaggaaatcttggagaaggttaacttttccgaagacttggtgttggttcctggaaaagaagcatcgaaaatgattattcgaagagcaaatcaggcaggtgttacgagagctgataaggacaatgtgaggacggtagattccttcttgatgcaccctccaaaaagggtgttcaaaaggttgtttatcgatgaaggtttaatgttgcacacaggctgtgttaactttttgacgttgctatctcattgtgatgtggcatacgtttacggtgacacacagcagattccctttatctgtagggttgcgaattttccttatccctcgcatttcgcgaagcttgttgttgacgagaaggaagatagaagggtcacgctcaggtgtccggcagacgttacatatttcttgaatacgaggtacgatggatcagtgatgtgtacaagctctgtggagaggtcggttagtgcggaggttgtgagaggaaaaggtgctttaaacccaataactttaccgttagaggggaaaattctcaccttcacgcaagccgataagttcgagttgttggataagggttacaaagatgtgaacacggttcatgaagttcagggcgaaacgtacgaaaagacagcgatcgttcggttaacagcgactcccttggagatcatatcaagagcgtcacctcatgttttggtggcgttgacaaggcacactactcgatgtaaatattacacggttgtgttggacccaatggtgaatgtgatttctgaactggggaaactgtccaactttcttctcgagatgtacaaggtggagtcggggacccaatagcaattacagatcgacacagtgttcaaagggacgaatctgttcgtcccgacgcctaagtcaggagattggcgagacatgcagttctattatgacactcttcttcccggaaacagtactattcttaatgagtttgatgctgtgacgatgaacttgagggatatttccttaaatgtcaaggactgtaggatcgacttctcgaaatctgtgcaagtgccgaaagagcggccggttttcatgaaacctaaattgaggacggcggcagagatgccacgtactgctggtctacttgaaaacctcgtcgcgatgattaaaagaaacatgaacgcaccagatttgacagggacgattgatatagaggacactgcgtcgttagtagttgaaaagttttgggatgcttatgtggtgaaagaattcagcggaacggacggaatggctatgacaagggaaagtttttctagatggctctctaaacaagagtcgtctacagttggtcagttagcggatttcaactttgtggatttgccggcggtggacgagtacaagcatatgatcaagagccaacccaagcagaagttagacttgagcattcaagacgaataccctgcattgcagactatagtctatcattcaaagaagatcaatgcgatttttggtcctatgttttcagagttgacgaggatgctccttgaaagaatagatacttccaagtttctgttttacaccaggaagacaccaacgcagattgaagagtttttctctgatttagattcgtcacaagcgatggagattttggagctcgacatttcaaagtatgacaagtcacaaaacgagttccattgcgctgttgagtacaaaatatgggaaaagcttggaattgacgagtggttagcggaggtgtggagacaaggacacaggaaaacgacgctcaaggactacactgctggcattaagacgtgtttgtggtaccaaaggaaaagcggtgacgtgactacctttattgggaacacaattatcattgcagcgtgtttgagttctatgatcccgatggacaaagtgatcaaggcggctttctgcggtgacgacagtttgatatatattccgaaaggtctagacctaccggatattcaagccggagccaaccttacgtggaactttgaggccaaattgttcaggaaaaagtacgggtatttttgcggtcgttacgttattcaccacgatagaggagctattgtatattatgatccgcttaagttgatatctaaattaggatgtaaacatattagagatgaagttcacttagaagagttgcgtagatctctgtgtgatgtaactagtaatttaaataattgtgcgtatttttcacagttagatgaggccgttgccgaggttcataagaccgcggttggcggagcgtttgtttactgtagtataattaaatatttgtcagataaaaggttgtttaaagatttgttttttgtttgactgagtcgataatgtcttacgagcctaaagttagtgacttccttgctcttacgaaaaaggaggaaattttacccaaggctttgacgagattaaagactgtctctattagtactaaggatgttatatctg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实施例2 YoMV侵染性克隆转化农杆菌并进行侵染烟草
取0.5 μg YoMV全序列的侵染性克隆质粒转化GV3101农杆菌，待农杆菌转化子长出后，挑取单菌落进行菌落PCR，挑取阳性克隆摇菌保藏；命名为YoMV‑GD（Agrobacterium tumefaciens），并进行了保藏。保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编510070；保藏日期2022年1月20日，保藏号为GDMCC No.62229。

[0026] 活化保藏的包含YoMV‑GD侵染性克隆载体 (图4) 的农杆菌，28℃培养14～16h，收集菌，用农杆菌悬浮缓冲液悬浮，28℃静置2～4h。用分光光度计测OD600，然后用农杆菌悬浮缓冲液调OD600至1.0，注射5～6叶期本生烟和普通烟以及3‑4叶期白萝卜和菜心。

[0027] 结果显示，注射第五天，本生烟即可出现坏死、花叶等症状，后期整株坏死；第7天普通烟也出现坏死、花叶症状 (图5)；萝卜接种后20天，接种YoMV‑GD植株明显矮小，长势弱，叶片黄化（图6A）；菜心接种YoMV‑GD后植株也整体偏矮小，叶片有轻微花叶及皱缩（图6B）。RT‑PCR结果显示接种YoMV‑GD的萝卜和菜心植株都可以检测到YoMV（图6C）。这些结果说明所构建YoMV‑GD侵染性克隆具有较强侵染性，可以用于抗病材料品种筛选、及YoMV病毒基因组结构、致病机制解析等研究。