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一种利用南瓜根茎花叶进行辅助育种的方法

花匠小妙招
2025-04-19 12:26

一种利用南瓜根茎花叶进行辅助育种的方法

1.本发明属于植物育种领域，具体涉及的是一种利用南瓜根茎花叶进行辅助育种的方法。

背景技术：

2.南瓜粗多糖是指没有过滤剔除天然蛋白、色素的复合型杂多糖，主要有黏多糖、脂多糖、结合多糖(糖蛋白及黏蛋白)等，无甜味、溶于水、不能结晶，直接水提醇沉的产物。天然多糖多以粗多糖作为活性物质，具有调节免疫、降血糖、降血压、抑菌抗炎、抗癌、抗疲劳等医疗保健作用，因此越来越被引起广泛重视。
3.近年来南瓜嫩茎、嫩叶及嫩瓜苗和雄花是兴起的优质绿色健康蔬菜，废弃的南瓜茎和叶也被作为动物青饲料利用。南瓜根系抗性强，常做为黄瓜、甜瓜、西瓜等砧木。不同南瓜品种的茎、叶、花、果、种子多糖含量有差异。大量文献报道了南瓜果实富含粗多糖，但关于南瓜中茎、叶(张强等，2016)、花和根中粗多糖的研究较少，运用生化法测定根、茎、叶和花中粗多糖与南瓜品质育种结合的报道更少。中国专利zl201410665850.3公开的是一种南瓜果实肌醇类和单双糖类物质的同时检测方法，该方法是利用gc-ms方法对南瓜进行检测，其检测对象仅可为南瓜果实，并不能实现对南瓜植株中根茎花叶等多器官的检测，且该方法由于使用gc-ms方法，检测耗时超过48小时，并不适用于南瓜早期品质育种。不单是南瓜，其他作物的类似报道也是甚少公开。

技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种利用南瓜根茎花叶进行辅助育种的方法。
5.本发明提供了一种利用南瓜中根、茎、叶和雄花中的粗多糖含量进行南瓜育种的方法，包括：检测南瓜中根、茎、叶和雄花蕾中粗多糖的含量，选择粗多糖含量高的南瓜器官植株，作为保留的备选株。
6.上述的方法中，所述粗多糖以葡聚糖或葡萄糖计。
7.上述的方法中，所述检测南瓜中根、茎、叶和雄花蕾中粗多糖含量的方法，包括如下步骤：
8.1)将南瓜根、茎、叶或雄花蕾作为待测样品，用液氮研磨得到细粉后，与蒸馏水混匀，水浴，水浴期间进行摇匀，冷却后补加蒸馏水得到样品提取液，过滤，收集滤液；
9.2)取步骤1)部分滤液与沉淀剂混匀离心，收集沉淀；
10.3)向步骤2)所得沉淀中加入分离试剂进行水溶性单糖和低聚糖的分离，再离心，收集沉淀后用蒸馏水溶解，得到粗多糖沉淀液；
11.4)取步骤3)部分粗多糖沉淀液，加入铜试剂溶液和氢氧化钠溶液进行沸水浴，冷却后离心，收集沉淀；
12.向所得沉淀中加入洗涤剂离心，再次收集沉淀，加入沉淀溶解剂，加水补足至既定容器，得到测定液；
13.5)取步骤4)部分测定液进行葡粗多糖的分解反应后，于分光光度计测定吸光度，将所得吸光度代入标准曲线，得到对应的葡萄糖或葡聚糖质量，记为m1，再将所述m1代入公式i，得到所述待测样品中粗多糖含量w；同时做样品空白试验，得到相应的样品空白液中葡萄糖或葡聚糖质量，记为m2；
[0014][0015]
所述公式i中，
[0016]
w：待测样品中粗多糖含量，以葡萄糖或葡聚糖计，mg/g fw；fw代表鲜样；
[0017]
m1：待测样品测定液中葡萄糖或葡聚糖质量，mg；
[0018]
m2：样品空白液中葡萄糖或葡聚糖质量，mg；
[0019]
m：待测样品的质量，g；
[0020]v1
：步骤1)中所述样品提取液的总体积，ml；
[0021]v2
：步骤2)中所述部分滤液的体积，ml；
[0022]v3
：步骤3)中所述粗多糖沉淀液的体积，ml；
[0023]v4
：步骤4)中所述部分粗多糖沉淀液的体积，ml；
[0024]v5
：步骤4)中所述测定液的总体积，ml；
[0025]v6
：步骤5)中所述部分测定液的体积，ml；
[0026]
且v2/v1≤1；
[0027]v4
/v3≤1；
[0028]v6
/v5≤1；且v6和v5均≥2ml。
[0029]
上述的方法中，所述v2/v1＝1/25-1/20；
[0030]
所述v4/v3＝2/5-1/1；
[0031]
所述v6/v5＝1/5-1/1；
[0032]
所述步骤1)用液氮研磨步骤中，所述细粉颗粒大于200目；具体为500-2000目；
[0033]
所述细粉与水的用量比为每0.1-0.3g细粉于2ml离心管中室温加水至2ml；
[0034]
所述水浴步骤中，温度为沸水温度；时间为30-60min；具体为30min；
[0035]
所述摇匀为在水浴过程中每5-10min进行一次摇匀；每次摇匀的时间为5-10s。
[0036]
步骤1)中，与蒸馏水混合的细粉的用量为0.1～0.3g。
[0037]
上述的方法中，所述步骤2)中，所述沉淀剂为无水乙醇；
[0038]
所述滤液与沉淀剂的体积比为1:4～1:1；具体为0.4ml：1.6ml；
[0039]
所述离心步骤中，离心转速为3000-5000r.min-1
；时间为3-5min。
[0040]
上述的方法中，所述步骤3)中，所述分离试剂为乙醇水溶液；具体为体积百分浓度为80％的乙醇水溶液；
[0041]
所述沉淀用所述分离试剂的体积用量离心管总体积的10-90％；
[0042]
所述离心步骤中，离心转速为3000-5000r.min-1
；时间为3-5min；
[0043]
所述收集沉淀后用水溶解步骤中，水的用量为离心管总体积的10-50％；具体为25％。
[0044]
上述的方法中，所述步骤4)中，所述铜试剂溶液由铜储备液、水和固体无水硫酸钠组成；所述铜储备液、水和固体无水硫酸钠的用量比为50ml：50ml：12.5g；其中，所述铜储备液由五水硫酸铜、柠檬酸钠和水组成；所述五水硫酸铜、柠檬酸钠和水的用量比为0.3g：3g：100ml；
[0045]
所述铜试剂标准溶液的用量为离心管总体积的10％-30％；
[0046]
所述氢氧化钠溶液为10wt％氢氧化钠水溶液；所述粗多糖沉淀液、10wt％氢氧化钠水溶液和铜试剂溶液的体积比为1：1：1；
[0047]
所述沸水浴步骤中，水浴时间为2min；
[0048]
所述冷却后离心步骤中，离心转速为3000-5000r.min-1
；时间为3-5min；
[0049]
所述洗涤剂由所述铜试剂溶液、10wt％氢氧化钠溶液和蒸馏水组成；所述铜试剂溶液、10wt％氢氧化钠溶液和蒸馏水的用量比为：10ml：10ml：50ml；
[0050]
所述洗涤剂的用量为离心管总体积的10％-50％；具体为25％；
[0051]
所述离心步骤中，离心转速为3000-5000r.min-1
；时间为3-5min；
[0052]
所述沉淀溶解剂为硫酸溶液；所述硫酸溶液的体积百分浓度具体为7-10％；所述硫酸溶液的用量为离心管总体积的1-10％。
[0053]
上述的方法中，所述步骤5)粗多糖的分解反应步骤中，所用反应试剂为苯酚水溶液和浓硫酸；所述苯酚水溶液的体积百分浓度具体为5％；
[0054]
所述苯酚水溶液、浓硫酸与所述测定液的体积比为1：10：2；
[0055]
反应条件为在沸水水浴中反应2min。
[0056]
上述的方法中，所述步骤5)所述测定吸光度步骤中，所述标准曲线按照如下方法制得：
[0057]
以葡聚糖/或葡萄糖的质量为横坐标，单位为mg/ml，葡聚糖或葡萄糖标准溶液的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0058]
其中，所述葡萄糖质量的单位为mg；
[0059]
所述葡聚糖的吸光度值对应的波长为485nm；
[0060]
所述葡萄糖的吸光度值对应的波长为490nm。
[0061]
所述育种包括将含多糖南瓜进行引种观察，再与自交系杂交，经过多代自交后，获得富多糖南瓜自交系，再经过多代自交后，得到富多糖南瓜高代自交系。
[0062]
更具体的，所述育种包括：按照图3所示方法进行育种，首先确定富含粗多糖的根茎叶和雄花南瓜育种目标，将优质口感佳南瓜幼苗在当地环境下进行引种观察，在种植期间以根、茎、叶和雄花为材料，按照上述发明方法对根、茎、叶和雄花进行快速实时多次检测，所得不同待测样品中粗多糖含量w，淘汰粗多糖w含量低的南瓜材料，选择粗多糖w含量高的南瓜材料作为自交材料，再进一步自交。重复该步骤6-7代甚至更多，直到形成稳定粗多糖含量高的南瓜纯合系。结合其它抗病、抗逆性状强优势组合测配，经多代杂交选育，在育种过程中实时监测南瓜任何发育阶段的根、茎、叶和雄花的粗多糖含量并进行粗多糖配合力测定，确定父母本，进一步开展品种比较试验、区域试验和生产试验等，最终获得粗多糖含量高和兼顾其它性状优良的新品种。
[0063]
本发明在南瓜种子发育早期和雄花蕾期运用生理生化测定多糖并与传统育种相结合开展南瓜品质育种。在传统水提法的基础上，分别选用南瓜根、茎、叶和雄花蕾，液氮预
处理碾磨成细粉后，2ml离心管装样0.1-0.3g，液料比1:15-20，离心转速3000-5000r.min-1
，通过此方法1个南瓜样品的提取时间为1.5h，测定时间为0.5h；而传统方法1个样品的提取时间为3.5h，测定时间为0.5h；利用本发明的测定方法，1个样品提取时间比传统方法缩短2h，若100个南瓜材料，可节约200h，如果有上千材料更加明显缩短提取和测定时间。该方法对检测样品取样量要求很低，仅取0.1-0.3g材料微量检测，降低了种植成本。加上在南瓜根、茎、叶和雄花发育早期进行快速实时多次检测，可较早的淘汰低多糖的材料。同时因液氮使南瓜细胞内产生较粗大的冰晶，冰晶越粗大细胞组织易受伤，更易于磨成细粉，液氮保存和预冷南瓜强化了多糖的提取，对于提取南瓜多糖十分有利，增加了多糖的提取率。本发明为南瓜早期育种中大批量快速筛选出粗多糖含量高的南瓜资源或新品种提供了一种微量、快速、高效、可靠且成本低的方法，在南瓜品质育种具有重要的应用价值。
附图说明
[0064]
图1为葡萄糖标准曲线。
[0065]
图2为葡聚糖标准曲线。
[0066]
图3为南瓜育种技术路线图。
具体实施方式
[0067]
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
[0068]
下述实施例所用浓硫酸的质量浓度为98％。
[0069]
下述实施例中所用桂丰4号南瓜品种，由广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所通过常规育种育成；公众可从申请人处获得，上述生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用；
[0070]
南瓜红星品种购买于上海惠和种业有限公司；
[0071]
ms液体培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
[0072]
实施例1筛选粗多糖含量高的食用嫩茎、嫩叶的南瓜及南瓜砧木
[0073]
一、试验材料：
[0074]
编号5南瓜(桂丰4号)和编号19南瓜(对照，红星)种子。种子常温浸泡4-5h，置于30℃恒温催芽箱2-3d，然后定植于ms液体培养基中，常规生产管理。真叶一般取催芽后7-10天的真叶，具体取自催芽后8天；根一般取自催芽后4-5天生长的胚根，具体取自催芽后5天；茎一般是催芽后7-10天的茎，具体取自催芽后10天。
[0075]
二、原理：利用高分子物质在80％乙醇溶液中沉淀，用碱性二价铜试剂选择性地沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚-硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含量。
[0076]
三、试剂：
[0077]
本方法使用试剂均为分析纯，所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。
[0078]
1.铜储备液：称取0.3g五水硫酸铜，3g柠檬酸钠，加水溶解并稀释至100ml，混匀，备用；
[0079]
2.铜试剂溶液：取铜储备液50ml，加水50ml，混匀，加入固体无水硫酸钠12.5g并溶解，临用新配；
[0080]
3.氢氧化钠溶液(10％)：称取10g氢氧化钠，加水溶解稀释至100ml，加固体无水硫酸钠至饱和；
[0081]
4.洗涤剂：取水50ml，加入铜试剂溶液10ml，氢氧化钠溶液(10％)10ml，混匀；
[0082]
5.乙醇溶液(80％)：水20ml加入无水乙醇80ml，混匀；
[0083]
6.硫酸溶液(10％)：取10ml浓硫酸加入水80ml，混匀，冷却后稀释至100ml；
[0084]
7.苯酚溶液(5％)：称取苯酚5g，加水溶解至100ml，混匀，置冰箱可保存1个月；
[0085]
8.葡聚糖或葡萄糖标准储备液：称取在105℃干燥至恒重的葡聚糖或葡萄糖1.0080g，加水溶解，并定容至100ml，混匀，置冰箱保存，此溶液每ml含10.080mg葡聚糖或葡萄糖；
[0086]
9.葡聚糖或葡萄糖标准使用溶液：吸取葡聚糖或葡萄糖标准储备溶液2ml置于100ml容量瓶，加水定容，混匀，置冰箱保存。
[0087]
五、仪器
[0088]
uv2700紫外分光光度计、离心机、旋转混匀器、恒温水浴锅。
[0089]
六、方法和步骤
[0090]
1.标准曲线制作
[0091]
1.1葡萄糖标准曲线制备
[0092]
精密吸取葡萄糖标准使用溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml(相当于葡萄糖0、0.04032、0.08064、0.12096、0.16128、0.20160mg)分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入苯酚溶液1.0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸l0 ml，于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中，煮沸15min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1.0cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，如图1所示。
[0093]
1.2葡聚糖标准曲线制备
[0094]
精密吸取葡聚糖标准使用溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml(相当于葡聚糖0、0.02000、0.04000、0.06000、0.08000、0.10000mg)分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入苯酚溶液1.0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸l0 ml，于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中，煮沸15min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1.0cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡聚糖标准曲线，如图2所示。
[0095]
2.南瓜粗多糖的提取和测定
[0096]
2.1滤液准备
[0097]
1.采摘南瓜的子叶、茎、真叶和根并进行随机取样，混匀后每个材料重复3次，立即存放于液氮。
[0098]
2.待测样品用液氮磨成细粉(细粉粒度为800-1000目)，混合均匀后称取0.3g(m)于2ml离心管；
[0099]
3.加双蒸水至2ml，沸水水浴30min，期间每隔5min摇匀离心管；
[0100]
4.冷却室温后补加双蒸水定容至10ml(v1)中；
[0101]
5.混匀后、用中性滤纸、过滤于10ml容量瓶中，滤液备用。
[0102]
2.2沉淀粗多糖
[0103]
1.吸取上步中备用滤液0.4ml(v2)于另一2ml离心管加1.6ml无水乙醇，离心3000-5000r.min-1
/3min，弃去上清；
[0104]
2.沉淀加500微升80％乙醇，离心3000-5000r.min-1
/3min；
[0105]
3.上述1和2步重复2次；
[0106]
4.离心后弃去上清、沉淀用0.5ml(v3)双蒸水溶解。
[0107]
2.3沉淀葡聚糖
[0108]
1.取0.2ml(v4)于另一2ml离心管，加入0.2ml 10％氢氧化钠溶液和0.2ml铜试剂溶液，沸水水浴2min；
[0109]
2.冷却后，离心3000-5000r.min-1
/3min，弃去上清，沉淀加入0.5ml洗涤剂，离心3000-5000r.min-1
/3min；弃去上清，沉淀加0.2ml 10％硫酸溶液溶解，双蒸水补齐至2ml(v5)补齐，混匀备用，此样品为测定液。
[0110]
2.4测定粗多糖
[0111]
1.将2ml(v6)测定液转至于25ml比色皿，加1ml 5％苯酚溶液，10ml浓硫酸，混匀沸水水浴2min；
[0112]
2.冷却后取2ml于比色皿中，分别在波长490nm(葡萄糖)，485nm(葡聚糖)紫外分光光度计中比色。以试剂空白为参比溶液测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖或葡聚糖的质量m1，计算样品中的粗多糖含量。同时做样品空白试验，得到样品空白液中葡萄糖或葡聚糖的质量计为m2。样品空白实验中的空白样品为蒸馏水。
[0113]
2计算公式i
[0114][0115]
所述公式i中，
[0116]
w：待测样品中粗多糖含量，以葡萄糖或葡聚糖计，mg/g fw；fw代表鲜样；
[0117]
m1：待测样品测定液中葡萄糖或葡聚糖质量，mg；
[0118]
m2：样品空白液中葡萄糖或葡聚糖质量，mg；
[0119]
m：待测样品的质量，g；
[0120]v1
：样品提取液的总体积，ml；
[0121]v2
：沉淀粗多糖步骤中所用滤液的体积，ml；
[0122]v3
：沉淀粗多糖步骤中粗多糖沉淀液的体积，ml；
[0123]v4
：沉淀葡聚糖步骤中所用粗多糖沉淀液的体积，ml；
[0124]v5
：测定液的总体积，ml；
[0125]v6
：测定粗多糖步骤中所用测定液的体积，ml；
[0126]
2.5试验结果见表1
[0127]
从表1可得出，编号5南瓜根、茎、子叶和真叶以葡萄糖计的粗多糖和以葡聚糖计的粗多糖均高于对照编号19。故此保留高粗多糖含量的编号5南瓜作为种质资源继续利用。同时编号5南瓜嫩苗口感好、产量高且抗病、抗虫、抗逆直接作为食用南瓜茎叶南瓜或砧木南瓜新品种。
[0128]
表1、南瓜根、茎、子叶和真叶中南瓜粗多糖的含量
[0129][0130]
实例2筛选食用雄花南瓜材料及品种
[0131]
2.1试验材料：
[0132]
编号6(桂丰4号)和编号19(对照，红星)南瓜雄花蕾。
[0133]
2.2原理、药剂、仪器等同实例1，简略方法步骤如下：
[0134]
南瓜粗多糖提取：
[0135]
采摘南瓜雄花蕾，液氮预处理样品后碾磨成细粉后，混合均匀后称取0.3g
→
补充水至2ml
→
沸水浴30min
→
冷却，水定容10ml
→
过滤
→
取滤液0.4ml
→
加无水乙醇1.6ml
→
混匀，离心(5000r/min，3min)去上清
→
加80％乙醇0.5ml
→
离心(5000r/min，3min)去上清
→
以上重复2遍
→
加水0.5ml
→
溶解
→
取以上溶液0.2ml
→
加10％氢氧化钠溶液0.2ml
→
加铜试剂溶液0.2ml
→
沸水浴2min
→
冷却，离心(5000r/min，3min)
→
去上清，加洗涤剂0.5ml
→
离心(5000r/min，3min)，去上清
→
加10％硫酸溶液0.2ml
→
溶解，加水补齐至2ml，得测定液。
[0136]
南瓜粗多糖测定：
[0137]
取待测液2ml
→
加5％苯酚溶液1ml
→
加浓硫酸10ml
→
混匀，沸水浴2min
→
冷却，取2ml，波长4490nm测定，结果见表2。
[0138]
2.3试验结果
[0139]
从表2可看出，编号6南瓜雄花蕾以葡萄糖计的粗多糖高于对照编号19。故此保留高粗多糖含量的编号6南瓜做为材料继续利用，因该编号雄花产量高且抗病、抗虫抗逆，也可作为食用花南瓜品种。
[0140]
表2 南瓜雄花蕾中粗多糖的含量结果
[0141][0142]
七、食用粗多糖含量高茎叶花的南瓜及砧木南瓜育种
[0143]
按照图3所示方法进行育种，将含多糖南瓜进行引种观察，再与自交系杂交，经过至少6-7代自交后，获得富多糖南瓜自交系，再经过6-7代自交后，即可获得富多糖南瓜高代自交系。该高代自交系品种的多糖南瓜嫩苗或即将开花时，其中南瓜各器官如雄花、子叶、茎、真叶和根中粗多糖含量均显著高于非高代自交系品种，且采用本发明提供的方法进行
检测，在南瓜发发育各个时期进行快速实时多次检测，液氮处理样品且取样量仅0.1-0.3g，检测时间较传统方法大为缩短，每次检测时间仅需要1.5h，在大批量南瓜多糖种质资源筛选中可明显缩短南瓜粗多糖的提取和检测时间，加之该方法能够实现微量检测，在大批量南瓜早期育种中具有非常明显的优势，能够实现微量、简单、快速和可靠的大批量检测，缩短育种周期有重要的应用价值。