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霍山石斛组织培养一步成苗的方法及使用的营养液的配方的制作方法

花匠小妙招
2025-04-21 08:25

霍山石斛组织培养一步成苗的方法及使用的营养液的配方的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物组培育苗的技术领域，具体涉及到一种霍山石斛组织培养的方法。
【背景技术】
[0002]霍山石斛(学名:Dendrobiumhuoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)俗称米斛，是兰科石斛属的草本植物。因其所含的生物碱、粗多糖、氨基酸、微量元素等成分具有强肾清音明目、保肝护嗓、滋阴清热、养胃生津、抑制肿瘤细胞生长、增强免疫力等功效，一直被视为九大“仙草”之首。
[0003]野生状态下，霍山石斛生长十分缓慢，其中极为细小，仅有一个简单的胚及单层细胞的翅状种皮构成，无胚乳，在自然状态下，极少萌发成苗，由于过度的采伐利用、生长缓慢、生态环境的恶化和繁殖率低等原因的影响，霍山石斛野生资源濒临灭绝。
[0004]通过植物组织培养的方法获得霍山石斛再生植株的方法有两个:(I)用霍山石斛成熟的种子消毒后进行无菌播种，萌发产生原球茎，然后进行芽诱导、茎诱导和根诱导，最后壮苗培养后产生种苗；(2)通过适宜的外植体诱导形成拟原球茎或者丛生芽，不断进行增值(产生一定数量)，然后进行芽诱导、茎诱导和根诱导，最后进行壮苗培养后产生种苗。
[0005]霍山石斛现有的组培育苗技术成本高(需要大量的劳动力成本)、时间长(从种子到成苗最少需要12个月以上的时间)、变异率高(由于进行对此增值和激素诱导，变异较多)、栽培成活率低(不断的增值使种苗的抵抗力变低，必须经过炼苗后才能栽培，且成活率只有80%左右)。
[0006]随着霍山石斛产业化规模的不断发展，对霍山石斛种苗的需求量也在不断地增加，低成本高质量的霍山石斛种苗是发展趋势。

【发明内容】

[0007]本发明的所要解决的技术问题在于提供一种成活率高、技术成本低、培训时间较短的霍山石斛组织培养一步成苗的方法及使用的营养液的配方。
[0008]本发明采用以下技术方案解决上述技术问题的:一种霍山石斛组织培养一步成苗的方法，包括下述步骤:
[0009]步骤一:固体培养基的制备，其中固体营养基的配方包括:
[0010]以下组成及配比的大量元素:
[0011]硝酸钾KN03:300 ?500mg/L ；
[0012]硫酸铵(NH4)2S04:400 ?600mg/L ；
[0013]磷酸二氢钾KH2P04:300 ?500mg/L ；
[0014]硫酸镁MgS04.7H20:200 ?300mg/L ；
[0015]硝酸钙Ca (N04) 2:400 ?500mg/L ；
[0016]以下组成及配比的微量元素:
[0017]碘化钾KI:0.65 ?0.95mg/L ；
[0018]硼酸H3B03:5.3 ?8.9mg/L ；
[0019]硫酸锰MnS04.4H20:19 ?25mg/L ；
[0020]硫酸锌ZnS04.7H20:6.5 ?9.8mg/L ；
[0021]钼酸钠Na2Mo04.2H20:0.10 ?0.45mg/L ；
[0022]硫酸铜CuS04.5H20:0.010 ?0.035mg/L ；
[0023]氯化钴CoC12.62:0.010 ?0.035mg/L ；
[0024]以下组成及配比的铁盐:
[0025]乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA:25.5 ?40.5mg/L ；
[0026]硫酸亚铁FeS024.7H20:22.5 ?30.5mg/L ；
[0027]以下组成及配比的有机成分:
[0028]肌醇CH (OH) 6:90 ?110mg/L ；
[0029]甘氨酸C2H5N02:1 ?3mg/L ；
[0030]盐酸硫胺素VBl:0.05 ?0.15mg/L ；
[0031]盐酸吡哆醇VB6:0.4 ?0.6mg/L ；
[0032]烟酸VB5 或 VPP:0.4 ?0.6mg/L ；
[0033]以下组成及配比的激素:
[0034]蔡乙酸NAA:0.6 ?0.9mg/L ；
[0035]6-节氛基嘌吟 6-BA:0.4 ?0.6mg/L ；
[0036]以下组成及配比的添加物:
[0037]鹿糖:25?35g/L ；
[0038]琼脂:3.5 ?5.5mg/L ；
[0039]花宝I 号:1.5 ?2.5mg/L ；
[0040]香蕉苹果混合提取液(2?4:1?2):120?200g/L ；
[0041]所述固体培养基的生产流程包括:水加热沸腾后，加入上述配方的琼脂，形成琼脂初混液，将上述组成及配比的添加物加水加热粉碎并浸出形成添加物浸出液，该添加物浸出液与上述琼脂初混液混合形成琼胶液，在该琼胶液内按上述组分和配方加入大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、激素，然后搅拌均匀，形成培养基初液，调节培养基初液Ph值至5.6-6.0，温度维持在50度到70度之间进行分装，分装后100°C?150°C灭菌1min?30min备用;
[0042]步骤二:液体营养液的制备:液体营养液的配方按照固体培养基的配方，不添加激素、琼脂、花宝I号和香蕉苹果提取液，所述液体营养液的生产流程包括:水加热沸腾后，按照液体营养液的配方加入各组分，混合定容后，调节培养基初液ph值至5.6-6.0，温度维持在50度到70度之间进行分装，分装后100°C?150°C灭菌1min?30min备用；
[0043]步骤三:霍山石斛果荚的选择和消毒:选择当年成熟饱满的霍山石斛硕果，表面无病斑、虫蛀和开裂，将采收的霍山石斛硕果进行清理，去除硕果表面枯萎的残花，并用清水反复冲洗，然后放入75%的酒精中至淹没为止，浸泡20min?50min，然后放在无菌的接种盘中在无菌操作台上晾干，备用；
[0044]步骤四:霍山石斛种子悬浮液的制备:无菌室超净工作台面上，用手术刀在硕果的一端切开一个小口子，用镊子夹住果柄，将切口对准瓶口，用另一只镊子轻轻敲打夹住果柄的镊子，将种子均匀的散落营养液中，并在无菌的环境下用磁力搅拌器将悬浮液搅拌均匀，并用悬浮计数法在显微镜下用计数板检测种子在悬浮液的密度，要求达到80?120粒/ml的密度；
[0045]步骤五:无菌播种:在无菌操台上，用灭菌后的移液枪从种子悬浮液中抽取1ml，放入固体培养基中，盖好瓶盖缓慢晃动，直至瓶内的悬浮液均匀的平铺在培养基表面为止，放入培养框中，送至培养室培养；
[0046]步骤六:种苗培养，刚开始10天是种子萌发阶段，采用暗培养，无光照，温度控制在24°C?27°C，10天-70天，为发芽阶段，这一时间段内，保证光照时间7?9小时，光照强度15001ux-20001ux，温度控制在25°C?28°C，70天?120天，为发生根阶段，这一时间段内，保证光照时间9?12小时，光照强度18001ux-21001ux，温度控制在24°C?27°C, 120天?180天，为壮苗阶段，这一时间段内，保证光照时间9?12小时，光照强度25001ux-30001ux，温度控制在24°C?27°C。在培过程中，若发现固体培养基被种苗吸收完不能够满足种苗继续生长需要时，用无菌移液枪在无菌操作台上将灭菌后的液体营养液加至培养瓶中，供应种苗继续生长；
[0047]步骤七:出苗。
[0048]本发明还提供了一种霍山石斛组织培养一步成苗的方法中使用的液体营养液，所述液体营养液的配方包括:
[0049]以下组成及配比的大量元素:
[0050]硝酸钾KNO3:300 ?500mg/L ；
[0051]硫酸铵(NH4)2S04:400 ?600mg/L ；
[0052]磷酸二氢钾KH2P04:300 ?500mg/L ；
[0053]硫酸镁MgS04.7H20:200 ?300mg/L ；
[0054]硝酸钙Ca (N04) 2:400 ?500mg/L ；
[0055]以下组成及配比的微量元素:
[0056]碘化钾KI:0.65 ?0.95mg/L ；
[0057]硼酸H3B03:5.3 ?8.9mg/L ；
[0058]硫酸锰MnS04.4H20: 19 ?25mg/L ；
[0059]硫酸锌ZnS04.7H20:6.5 ?9.8mg/L ；
[0060]钼酸钠Na2Mo04.2H20:0.10 ?0.45mg/L ；
[0061]硫酸铜CuS04.5H20:0.010 ?0.035mg/L ；
[0062]氯化钴CoC12.62:0.010 ?0.035mg/L ；
[0063]以下组成及配比的铁盐:
[0064]乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA:25.5 ?40.5mg/L ；
[0065]硫酸亚铁FeS024.7H20:22.5 ?30.5mg/L ；
[0066]以下组成及配比的有机成分:
[0067]肌醇CH (OH) 6:90 ?110mg/L ；
[0068]甘氨酸C2H5NO2:1 ?3mg/L ；
[0069]盐酸硫胺素VBl:0.05 ?0.15mg/L ；
[0070]盐酸P比B多醇 VB6:0.4 ?0.6mg/L ；
[0071 ]烟酸 VB5 或 VPP:0.4 ?0.6mg/L ；
[0072]以下组成及配比的添加物:
[0073]鹿糖:25?35g/L。
[0074]采用上述方法进行霍闪石斛的培育的优点在于:
[0075]1、缩短了霍山石斛的培养周期，6个月可以出苗，既种子成熟10月份播种，第二年的4月份就可种苗，刚好赶在栽苗期；
[0076]2、降低了 50%的霍山石斛组培育苗的成产成本，减少农户种植投入；
[0077]3、在育苗过程中，基本不改变其营养成分，只需根据其生长需要适当增加营养液即可，大大减少了因过多转分和生长环境的改变造成的变异；
[0078]4、在育苗过程中，主动吸收改造所需营养成分，增加栽培的成活率和发芽率。
【附图说明】