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文献集锦

花匠小妙招
2024-09-19 01:21

2024年2月，苏黎世联邦理工学院农业科学研究所在The Plant Journal上发表了研究成果，将BSA与全基因组深度测序和高质量基因组组装相结合，从而精确定位二元性状相关区域，并准确定义部分候选基因。

文章题目

High-resolution bulked segregant analysis enables candidate gene identification for bacterial wilt resistance in Italian ryegrass (Lolium multiflorum Lam.)

第一作者：Florian Goettelmann

通讯作者：Roland Kölliker

通讯单位：苏黎世联邦理工学院农业科学研究所

杂志：The Plant Journal

影响因子：7.2/Q1

文章链接：

https://doi.org/10.1111/tpj.16693

研究背景

多花黑麦草(Lolium multiflorum Lam.)是一种广泛种植的牧草品种，因其产量高、营养价值高以及快速覆盖地面而闻名，它为温带气候地区的反刍家畜生产提供了重要的饲料来源。然而，它也会受到病害的影响，其中最重要的是由Xanthomonas translucens pv. graminis(Xtg)引起的细菌性枯萎病。细菌主要通过植物伤口侵入，在木质部维管中扩散，破坏水分和养分的流动，导致叶片枯萎和变黄、生长受阻，最终导致植物死亡，造成严重的产量损失。此外，由于气候变化可能会增加有利于病原体的发生条件、扩大其地理范围或影响寄主与病原体之间的相互作用，这一疾病的全球影响可能会变得更加严重。

唯一有效、持久且经济可行的方法就是培育抗病栽培品种，迄今为止，抗Xtg栽培品种的培育工作都是基于Xtg感染后对抗性个体的反复表型选择。然而，由于黑麦草的异花授粉特性，这些栽培品种在遗传上是异质的，基于表型观察的经典育种方法无法固定显性等位基因，因为它们会掩盖易感性等位基因，从而使其在群体中得以保留。根据这一目标，可利用基因组学辅助育种确定抗性等位基因，并通过定位与抗性相关的特定遗传标记，将抗性等位基因整合到多花黑麦草优良品种中，从而提高育种过程的效率。不过，这种方法需要对抗病性及其基因控制有透彻的了解。

技术方案

BSA➕高深度全基因组测序

研究意义

研究确定了与Xtg抗性高度相关的遗传变异，并可将其用作标记辅助选择的诊断标记。虽然还需要进一步验证才能确认其有效性，但已鉴定的变体具有作为分子标记用于标记辅助育种应用的巨大潜力，为在多花黑麦草栽培品种中高效选择细菌枯萎病抗性奠定了基础。

Xtg-ART-F2群体

对细菌性枯萎病的抗性分离

温室中有7484个Xtg-ART-F2个体的状况发展符合预期，在感染后14天(dpi)出现最初症状，并随着时间的推移变得越来越严重。由于很难将老叶的自然死亡与Xtg症状区分开来，因此大多数健康植株在21和28 dpi时的评分为2分。在第三次评分后将植株剪切，就能区分自然叶片衰老和Xtg症状，在49 dpi时，有1165株(15.5%)植株没有出现任何症状，而有1140株(15.2%)植株已经死亡。从这两组植株中，根据所有三个时间点的得分，选出抗性最强和最易感的个体，总共有750株抗性植株和761株易感植株被用来组成两个测序池。

▲在接种Xtg(dpi)后14、21和28天以及在接种Xtg(dpi)后3周，剪切植株并让其再生后，7484个Xtg-ART-F2群体的细菌性枯萎病评分分布

Xtg-ART-F2祖父母

染色体水平基因组组装结果

对代表Xtg-ART-F2群体抗性个体进行染色体水平基因组组装，共有78,219个scaffolds被成功锚定到Rabiosa集合的7 个假染色体上，来自M2289组装的3912个scaffolds被锚定到829个较大的scaffolds上(未锚定到Rabiosa集合)。此外，来自M2289集合的47,448个scaffolds无法被锚定，这很可能是由于多花黑麦草基因组中重复序列的比例较高，以及M2289组装的高度碎片化。M2289的染色体水平基因组组装在下文中称为“M2289_v2”。

为了将M2289_v2与Xtg-ART-F2群体中易感祖先的基因组序列进行比较，研究人员对由117,277个scaffolds组成的Adret基因组组装草案采用了类似的方法，以生成“Adret_v2”基因组组装，共有72,888个scaffolds被锚定到假染色体上，3596个scaffolds被锚定到来自Rabiosa汇编的795个较大scaffolds上，40,793个scaffolds未被触及。

▲利用|ΔSNP|指数、G值和ED值计算出多花黑麦草材料与Xtg的抗性相关性

pseudo-chromosome 4的300 kb区域

与抗药性高度相关

通过对两个池进行全基因组测序，共获得了606,760 Gb的DNA 序列信息，对读数进行处理和过滤后还余490,386 Gb。将读数映射到 M2289_v2基因组组装后，结构变异调用共得到 7 965,619个双等位基因变异，包括7,068,640个SNPs和896,979个Indels，过滤处理后最终共有7,525,443个变异用于后续分析。

用于检测每个变体与抗性相关性的所有三种方法(|ΔSNP|指数、G值和ED值)都显示出与pseudo-chromosome 4有明显相关性，峰值很高，横跨假染色体的大部分。然而，由于测序错误或测序的随机性造成的波动，可以看出存在较高程度的噪音，这些波动阻碍了对pseudo-chromosome 4上抗性关联度最高区域的精确鉴定。

▲以M2289_v2为参考基因组组装，用t-|ΔSNP|指数、G'值和 ED4值计算的各变异与多花黑麦草抗性的相关性，包括所有pseudo-chromosomes或pseudo-chromosomes 4上与抗性相关性最高的区域

减少噪音后在pseudo-chromosome 4上区分出一个明显的峰值，该峰值超过了t-|ΔSNP|指数的99%置信区间和G'值的99%阈值。在所有方法中，与抗性关联最强的是pseudo-chromosome 4上的一个相似位置，而在任何其他假染色体上都没有发现与抗性的关联。通过ED4方法，在M2289_v2基因组组装中可以看到一个尖锐峰值，大约从28,800,000 bp~28,900,000 bp，该区域被选中进行进一步研究。在Rabiosa中也观察到了类似的结果，用ED4法在大约163,280,000 bp~163,400,000 bp之间观察到了尖锐峰值。

通过对这两个区域内的注释基因序列进行基于BLASTn的比较，确定了一部分与M2289_v2中相对应的区域。为了更好地比较这两个区域，研究人员确定了Rabiosa中与M2289_v2区域相对应的更大区域，跨度从163,094,000 bp~163,410,000 bp，并选择该区域作进一步分析，进而发现了可能与抗病性有关的基因簇。

▲Rabiosa基因组、抗性祖代M2289_v2基因组和易感祖代Adret_v2基因组中候选区域内基因的比较

在候选区域发现多个候选抗性基因

在M2289_v2和Rabiosa候选区域中分别发现了12个和9个注释基因，这些基因与参与抗病的基因具有相似性，并被定义为Xtg抗性候选基因。这些基因包括与Pik-2-like和RGA 4-like抗病蛋白相似的基因，以及在两个基因组组装中都发现的两个CRK；在M2289_v2组合中的候选区域还包含两个类似RGA5的抗病蛋白，而在Rabiosa组合中则发现了四个SERPIN基因；在Rabiosa中有一个基因与逆转录转座子同源，一个基因与组蛋白去乙酰化酶同源，但这些基因与抗病性无关；在 M2289_v2和Rabiosa中分别有8个和4个基因无法注释，因为没有发现与任何已知基因匹配的基因；此外，在M2289_v2中，该区域包含17个缺口，横跨约100 kb，而Rabiosa组合中的相应区域横跨约300 kb，没有任何缺口，这表明该区域可能存在其他基因，但在M2289_v2中却搜索不到。

Rabiosa的Pik-2-like抗病蛋白基因evm.TU.chr4.21718与M2289_v2 中发现的7个Pik-2-like基因的区域同源，表明它们可能对应于一个基因，与Rabiosa中发现的基因同源。在Rabiosa的注释中还发现了与M2289_v2中两个RGA5-like抗病蛋白的基因(XLOC_055976和XLOC_055978)具有同源性的区域，但未被预测为基因。总体而言，对M2289_v2和Rabiosa注释中的候选基因以及易感祖代Adret_v2的更新基因组组装进行比较后发现，这三个基因组组装中的大多数基因都是保守的。但是，在M2289_v2和Adret_v2中都未发现与Rabiosa基因(evm.TU.chr4.21738和evm.TU.chr4.21749)的同源性，只在Adret_v2中发现了与evm.TU.chr4.21750的同源性。

▲候选区域内导致注释基因氨基酸变化的变体的抗性等位基因频率

以M2289_v2为参照，在候选区域共发现了3213个变体，以Rabiosa为参照，发现了3177个变体。其中，分别有880个和1010个变体在易感基因库和Adret易感祖代中不存在或出现频率很低，这与易感个体或群体中显性抗性等位基因的不存在或出现频率低有关。以M2289_v2为参照，在11个基因的编码序列中发现了101个这样的变体，在总共8个基因中发现了54个引起非同义氨基酸变化的变体。XLOC_000927、XLOC_021628和XLOC_017025中的等位基因频率表明，这三个基因在M2289祖先的这些位点上是杂合的，而其余五个基因在M2289中为同源。

在Rabiosa基因组中，共在6个基因的编码序列中发现了74个具有抗性等位基因的变体，在这6个基因中还发现了47个导致非同义氨基酸变化的变体。这些变异大多在M2289抗性祖代中为同源变异，只有8个在evm.TU.chr421718、evm.TU.chr421747和evm.TU.chr421750中为杂合变异。