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蛋白质替代疗法中的 mRNA

花匠小妙招
2025-04-30 18:50

替代疗法是一种医学治疗手段，目的在于补充或替代因患者基因突变导致的特定蛋白质缺失。传统上，这种疗法需要通过体外表达和翻译药物蛋白质，然后进行复杂的纯化步骤，这一过程既昂贵又艰难。然而，SARS-CoV-2 大流行期间，mRNA 药物被用于快速生产抗原，显示了体内翻译外源性 mRNA 的可行性。这种需求推动了体外转录和纳米脂质载体等技术的快速发展。本文综述了 mRNA 在蛋白质替代疗法中的临床前和临床应用，包括体外转录生产修饰的 mRNA、细胞内递送载体，以及与成品相关的质量属性。

针对遗传和先天性代谢缺陷的疾病，传统治疗往往仅缓解症状而非治愈病因。因此，科学界一直关注那些能解决根本问题的疗法，如 DNA 疗法和 RNA 疗法。尽管基因治疗的基因编辑形式经常被讨论，但 RNA 疗法也显示出巨大潜力。RNA 疗法基于 RNA 分子的调控和编码功能。反义寡核苷酸 (ASO) 通过与宿主 RNA 转录物的互补序列结合来调节其表达，已有 FDA 批准的 ASO 药物用于治疗多种疾病。小干扰 RNA (siRNA) 通过与 RNA 诱导沉默复合物 (RISC) 相互作用，诱导 RNA 干扰 (RNAi)，从而靶向并降解特定 mRNA，阻断基因表达。siRNA 药物已被用于治疗 TTR 淀粉样变性和肝卟啉症。microRNA 通过与 RISC 形成复合物来抑制靶标 mRNA 的翻译或促进其降解。RNA适体则通过与异源靶标（如蛋白质和碳水化合物）相互作用，展现出不同的调控模式，其功能灵活性主要来自于其三级结构。

信使 RNA (mRNA) 能够编码肽或蛋白质并触发其在细胞中的临时表达，这一特性已被应用于通过 mRNA 蛋白质替代疗法补充蛋白质缺陷，或通过 mRNA 疫苗实现抗原的表达。mRNA 通过基因组 DNA 的转录生成，负责将遗传信息传递给细胞的翻译机制。在这一发现之后，科学家们通过体内注射外源 mRNA 并观察其引发蛋白质表达的能力，来验证这一新发现。这标志着 mRNA 蛋白质替代疗法的诞生，目前主要被用于研究治疗罕见单基因疾病的新方法。这些疾病是由人类基因组中的单基因突变引起的，导致相应的蛋白质功能异常或完全缺失。尽管这些被称为“孤儿”的疾病较为罕见，但因其种类繁多，共同影响着全球大量的人群。因此，许多国家通过立法鼓励制药公司开发针对这些疾病的孤儿药，尽管其成本高昂。

蛋白质替代方案——为什么选择 mRNA？

除了 mRNA，还有其他方法可以实现蛋白质替代，比如基因治疗和利用生物分子工程生产重组蛋白。基因治疗的核心机制是通过向受影响细胞递送并整合正常基因，以替换缺陷或缺失的基因，恢复蛋白质表达，治疗遗传性疾病。然而，直接将蛋白质递送至目标组织是实现蛋白质表达的更直接方式。这种方法的优势在于避免了细胞翻译过程，有利于剂量控制，能在组织中实现高蛋白质浓度，并比病毒递送的基因治疗更易于控制。虽然蛋白质的直接施用已成功用于多种疾病，确保了激素、酶、凝血因子和干扰素的替代，但重组蛋白的使用在某些情况下并不适用。这主要由于其半衰期短、稳定性差和潜在的免疫原性，限制了其广泛应用。此外，这种方法不适合替换细胞内的蛋白质，如转录因子和其他调节分子。

使用核酸替代蛋白质，虽然避免了直接蛋白质递送的挑战，提供了更大的灵活性，但也存在一些固有缺陷。基因治疗的插入方式既带来了优势，也带来了局限性。尽管病毒载体的使用可以确保基因的持续表达，但可能会改变基因组并增加肿瘤发生的风险。并非所有病毒载体都会整合到基因组中，但它们对特定组织的倾向性使它们成为理想的载体；然而，这也可能引发其他问题，如中和抗体的出现、药代动力学问题以及基因加载的困难。相比之下，非病毒递送方式，如用于递送质粒 DNA 的脂质体、树状聚合物、固体脂质纳米颗粒和聚合物胶束，具有较低的免疫原性和致癌性，但转染效率较低。

通过比较这些蛋白质替代方法，可以得出结论：基于 mRNA 的治疗方法具有显著优势，包括避免插入细胞核和转录过程、增强安全性和作用的短暂性，从而消除了诱变风险。从监管角度看，mRNA 蛋白质替代疗法不涉及基因改变，因此可能更易于获得立法支持。然而，mRNA 疗法也存在副作用，如可能被 RNase 切割并引发先天免疫反应，导致细胞因子诱导的毒性。通过使用 modRNA 技术，用假尿苷替代尿苷，可以减少 TLR 和核酸酶对 mRNA 的识别，降低免疫原性。多项研究表明，modRNA 在提高蛋白质表达水平方面有额外优势，同时显著降低免疫原性效应。图 1 展示了 mRNA 从发现到作为 COVID-19 疫苗在全球推广的时间线。

图 1. mRNA 历史上主要事件的时间表。Clin：临床，Preclin：临床前，iPSC：诱导多能干细胞，Inj：注射，CAR：嵌合抗原受体，DC：树突状细胞。

蛋白质替代疗法中 mRNA 生产的考虑因素

目前，用于蛋白质替代疗法的 mRNA 可以通过体外转录反应 (IVT) 在无细胞环境中合成。IVT 过程在批次或连续生物反应器中进行，并通过监测和控制反应条件如 pH 值和温度来优化。IVT 的关键成分包括线性化的 DNA 质粒（作为转录 mRNA 的模板）、RNA 聚合酶（负责 mRNA 的合成）、dNTP（构成 mRNA 的基本单元），以及在某些情况下使用的 5' 帽类似物。反应还需在含有镁离子和氯化钠的缓冲溶液中进行，通常选择 HEPES/Tris 作为缓冲液。为了保护反应和提升产物的完整性，可能还会添加额外的试剂，如 RNAse 抑制剂、焦磷酸酶、二硫苏糖醇和多胺，这些试剂有助于提高最终的产量。

成功蛋白质生产的 mRNA 架构

所得 mRNA 的翻译效率取决于其结构和化学成分，这取决于接受 IVT 的质粒的设计和反应中使用的 IVT 试剂。适合蛋白质替代疗法的 mRNA 必须具有适当的 5' 帽以及 5'–3' 非翻译区 (UTR) 和一个开放阅读框，旨在最大限度地提高蛋白质产量。用于优化 mRNA (modRNA) 的修饰如图2所示。

图 2. modRNA 的架构。对序列（质粒水平）和化学（IVT 水平）的修饰可以提高 mRNA 的翻译效率并将细胞先天免疫机制的激活降至最低。

在生产用于蛋白质替代疗法的 mRNA 的 IVT 反应中，加帽方法的选择至关重要。mRNA 必须在其 5' 端具有帽结构才能发挥其功能。没有 5' 帽，mRNA 分子将缺少翻译所需的关键区域，并且容易被细胞内降解。目前有两种主要的加帽方法：共转录加帽和转录后加帽。共转录加帽在 IVT 主反应期间进行，T7 RNA 聚合酶在转录过程中掺入“Cap 1”类似物，例如 Trilink 的“Cleancap”。转录后加帽则在 IVT 完成后通过牛痘病毒加帽酶形成 5' 帽，该酶进一步转化为 Cap 1。尽管转录后加帽提供了 100% 的加帽率，但与共转录方法的 90% 加帽率相比，它需要额外的反应器和纯化步骤，增加了程序的复杂性。

mRNA 的 5' 和 3' UTR 区域位于氨基酸编码序列的两侧，虽然不参与翻译，但它们通过调节 mRNA 与 RNA 结合蛋白和核糖体的相互作用，以及提供 microRNA 结合位点，发挥重要的调节作用。研究表明，设计 5' UTR 区域时应在质粒水平上避免包含起始和终止密码子的序列，以减少 mRNA 上形成区域二级结构的倾向，这有助于增强 mRNA-核糖体的相互作用并提高蛋白质产量。对于 3' UTR 区域，设计策略则相反，应包含有助于形成二级结构的序列。一个有效的设计策略是利用已知高表达 mRNA 的 3' UTR 序列，如 α- 和 β- 珠蛋白的 3' UTR 序列。其他提高 mRNA 稳定性和蛋白质产量的方法包括使用多个 3' UTR 拷贝，例如将两个 β- 珠蛋白 3' UTR 序列首尾相连，或结合“融合 UTR”，如 AES 3' UTR 和 mtRNR1 3' UTR 之间的杂交产物。

开放阅读框 (ORF) 是 mRNA 中对应于最终蛋白质氨基酸序列的部分，在质粒中以无内含子的形式编码。通过多种修饰，可以增强 mRNA 的稳定性并提高其翻译效率，使得每个 mRNA 分子能产生更多的蛋白质。在设计质粒时，可以通过选择与人类 tRNA 种类丰富的同义密码子来优化密码子序列，从而提高翻译率。此外，通过调整序列以获得较高的 GC/AU 比率，可以受益于序列优化。这种优化的基本原理是，与原始的 AU 丰富的序列相比，GC 丰富的序列受到的转录后调控较弱，因此更易于被核糖体翻译。另一种减少转录物 U 含量的方法是使用翻译耐受的类似物，如假尿苷和 N1-甲基假尿苷（分别为 Ψ 和 m1Ψ），来替代尿苷。这种替代有助于 mRNA 产物逃避细胞内 Toll 样受体 (TLR) 的识别，TLR 介导细胞对入侵 mRNA 的先天降解反应。如果缺乏足够的 Ψ 和 m1Ψ 替代，所提供的 mRNA 会触发细胞的先天免疫反应，并被标记为“外源”以进行降解，从而显著减少可用于翻译的转录本数量。Ψ 和 m1Ψ 替代是在 IVT 反应中通过向反应器中添加含有这些类似物的 dNTP 混合物来实现的。

mRNA 的另一个特征是 Poly(A) 尾巴的存在，可以防止过早降解，从而增加其稳定性。Poly-A 尾位于成熟 mRNA 的 3' 端，包含重复的腺嘌呤序列。通常，100-120个腺嘌呤的优化长度可提高蛋白质替代疗法转录本所追求的翻译效率。虽然在体内转录过程中，mRNA 的聚腺苷酸化是使用一种称为聚腺苷酸聚合酶的单独酶进行的，但采用这种策略的 IVT 会不必要地使反应复杂化并增加成本。T3、T7 或 SP6 等 IVT 聚合酶也可以使转录物聚腺苷酸化，尽管它们往往会产生尾部长度可变的终产物。通过在要转录的质粒中编码多聚腺苷酸尾，可以避免上述并发问题，从而确保 mRNA 尾长度的一致性。

IVT 反应后，必须纯化所得 mRNA，以去除污染物并获得药物级 mRNA。广泛采用的纯化程序是层析法，例如离子交换、亲和聚（dT）和离子对反相层析法。这些层析技术通常与切向流系统步骤配合。图 3总结了直到纯 mRNA 产生为止的过程。然后，产品就准备好进入下一步，即掺入构成细胞递送载体的所选递送载体中。

图 3. 基于质粒体外生产 mRNA。编码内含子缺失优化mRNA序列的质粒首先被线性化，然后与RNA聚合酶、dNTPs、缓冲系统和补充试剂一起添加到反应器中。然后通过层析和过滤技术纯化所得产物，并准备封装到递送载体中。

将 mRNA 递送至细胞的载体

已经实施了许多将 mRNA 安全递送至靶细胞的方法，所有这些方法都有各自的优点和局限性。主要原理包括保护mRNA免遭降解以及将其有效且迅速地运输至靶细胞。运输方式主要包括病毒载体和非病毒载体，分为聚合物载体、脂质载体和聚合物-脂质混合载体。

基因治疗最重要的部分之一是将这一重要基因有效递送至靶细胞或靶组织。它可以取代现有基因或不起作用的基因；它可能会沉默基因或使已突变为不利形式的基因失活。对于基因治疗和 mRNA 递送，低免疫原性也至关重要。

病毒疗法或在研究和临床实践中利用转基因病毒已被广泛研究了数十年，但大多都失败了。病毒载体由作为核酸转运体的病毒组成，具有带或不带病毒囊膜的蛋白质衣壳、重要基因以及对基因整合和表达至关重要的关键病毒元件。病毒部分通常可以是逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒，但也使用了甲病毒、小核糖核酸病毒和黄病毒。病毒载体通常表现出较高的转导效率和广泛的趋向性，此外它们的生产现在可以扩大规模。它们成功的一个限制可能是目标人群中预先存在的对病毒载体的免疫力。

非病毒载体展现了纳米技术的新篇章；它们非常有前途，在 COVID-19 大流行期间已广泛用于目前市场上的两种 mRNA 疫苗中。这些载体基于阳离子聚合物纳米颗粒 (NP) 的静电特性，可与它们封装的带负电荷的 mRNA 相互作用。天然存在的聚合物包括壳聚糖，而合成聚合物包括PLL（聚-L-赖氨酸）、PAMAM（聚酰胺胺）、PEI（聚乙烯亚胺）和PAA（聚丙烯酸）。在选择最佳纳米颗粒时，应考虑这些纳米颗粒的某些特性，即它们的电荷密度、分子量、毒性特征和药代动力学特性，例如分布、生物降解和清除。为了获得最好的结果，必须对这些纳米颗粒进行某些修改。

mRNA 有效封装和递送的另一种方法涉及使用脂质纳米颗粒 (LNP) 或脂质双层壳，由具有水性中心的阳离子脂质组成。其它分子，如胆固醇或 PEG（聚乙二醇），以聚乙二醇化脂质的形式，也是最终递送结构的一部分。这些 LNP 的主要限制是由于阳离子壳及其与血浆蛋白的相互作用而导致其快速清除。最近研究和开发的某些脂质，如 1,2-二油酰基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷 (DODMA) 或 1,2-二油酰基-3-二甲基丙烷铵 (DODAP) 在循环中实现了几乎中性的电荷。结果，LNP 的半衰期延长了。必须指出的是，LNP 的关键特性决定了它们的行为和稳定性，例如粒径、δ 电位（聚集）、内体释放倾向、体内分布等，可以通过仔细选择 LNP 成分来定制。已知 PEG 脂质的包含会影响所得颗粒的 zeta 电位和尺寸，通过抑制其聚集来增加结构的稳定性。所使用的 PEG 百分比以及 PEG 缀合也在 LNP 的特性中发挥作用。例如，较大的 PEG 百分比可以导致较小的 LNP 的形成。携带C14烷基链的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基偶联物也可以改变行为，与使用C18 1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲氧基偶联物相比，它在血液中的循环时间更短，细胞递送率更高。胆固醇及其类似物可以对 LNP 的形态和性质产生有利的影响。引入对尾部进行各种修饰的胆固醇类似物可以将 LNP 的形状从球形改变为多面体，显示转染效率并使这些颗粒具有针对肝内皮细胞和 Kupffer 细胞的“归巢”能力。最后，已经提到的 DODMA 和 DODPA 具有低 zeta 电位，形成的 LNP 尺寸小，并且有在脾脏中积聚的倾向；因此，它们在靶向该器官时可能有用。

鉴于 SARS-CoV-2 大流行，LNP 的生产已得到简化，以满足全球对 mRNA-LNP 疫苗前所未有的需求。因此，微流体等技术已被引入“战场”，以可重复地提供具有统一质量的 mRNA-LNP 物质。图 4展示了最广泛使用的 mRNA-LNP 生产技术的示意图。

图 4. 脂质纳米颗粒的形成。如今，LNP 是利用微流体技术生产的，可产生均匀且表征良好的最终产品。封装材料（各种天然或改性脂质）与 mRNA 一起被送入设备中。由此产生的 mRNA-LNP 被进一步纯化，以确保适合人类使用。

最后，还有结合上述两种方法的聚合物-脂质混合载体方法，提供稳定性和强大的热力学特性，并在靶标中有效递送 mRNA。

原文：T.Vavilis, E.Stamoula, A.Ainatzoglou, et al., mRNA in the Context of Protein Replacement Therapy. Pharmaceutics, 2023.

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