佛手挥发油的用途.pdf
技术领域
本发明涉及佛手挥发油的新用途，尤其涉及佛手挥发油对中药材或作物根腐病的防治作用，属于生物农药技术领域。
背景技术
三七（Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen）又名田七，为五加科人参属多年生草本植物，具有散瘀止血、消肿定痛等功效，是中国特有的名贵栽培药用植物，主产地在我国西南地区，其中在云南省文山州距今已有400多年的栽培历史。三七根、茎、叶、花均可入药，用药范围非常广泛，社会需求量在不断增加，随着三七种植面积的迅速增加，其病害问题日益严重，已成为三七生产的主要障碍。大多数中草药的栽培都具有道地性，受地质土壤特性、气候条件及种植传统等因素的影响，因而不可避免的存在大量的连作，造成产量及品质降低，药效下降，已成为农业生产中亟待解决的问题。
目前，对三七病害的防治主要依赖各种化学药剂，化学农药虽有效，却大大增加了农民的投入成本，更严重污染了土壤和降低了药材品质。在现代农业生产中，化学农药被广范应用于病虫害的防治，是目前植物病害防治的主要手段。然而，它的致命缺点是在使用化学杀菌剂量、杀虫剂时存在“3R”（残留、抗药性和再生）问题，高残留的农药会造成严重的环境污染。例如，恶霉灵是一种新型农药，对疾病的预防和控制有着独特的作用，然而它对皮肤和眼睛有刺激性，会引起肝毒性。
植物挥发油不仅限于传统医药、食品、烟草、酒精和烟草，还可用于植物保护 (杀虫、抑菌、除草等)，这无疑为植物生态系统的利用开辟了一条新的途径。植物挥发油作为植物源农药应用于植物保护领域，与建议的无公害农药理念一致。从这个意义上说，植物挥发油也可以被归类为第三代农药。
佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle）是芸香科植物，常绿灌木或小乔木，通常用作中药，或因其果形奇特，而作为观赏植物。
目前未见佛手挥发油用于农作物病虫害防治的任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供佛手挥发油的一种新用途，是在生物农药领域中的应用，即在制备防治中药材或作物根腐病的化肥或农药中的应用。
本发明所述的佛手挥发油的用途，是将佛手挥发油用作制备防治中药材或作物根腐病的制剂，即以佛手挥发油为活性成分，在制备防治致病菌制剂中的应用。
本发明所述防治致病菌制剂的成分（或有效成分）为佛手挥发油，还可以加入一种或多种中药和农作物病害防治制剂上可接受的辅料，或者与其他活性成分复配发挥协同抑菌作用。
佛手挥发油可以通过现有技术设备制备成各种剂型的农药或各种形态的化肥。
在本发明中测定了佛手挥发油对孢子萌发和菌丝生长的抑制作用，佛手挥发油与恶霉灵的MIC值为同一数量级，抑菌效果相当。将佛手挥发油与化学农药恶霉灵进行复配，发现其对多个菌株的抑菌效果均具有加和和协同作用；通过佛手挥发油和化学农药协同增效，达到减少化学农药施用的目的。
本发明中佛手挥发油是通过常规水蒸气蒸馏法提取，无水硫酸钠干燥挥发油而制得，该制备方法简单，所需试剂成本低，有利于大量生产。
佛手挥发油作为一种天然的杀菌活性物质，在使用后其活性消失或被微生物分解，对环境无污染，对人畜安全；由于佛手挥发油是植物源提取物，其有效成分复杂多样，对病原菌为多成分多靶点的作用机制，使得靶标生物不易产生对某种或某几种成分产生抗药性，从而获得持久的防治效果；与化学合成农药相比，佛手挥发油的有效成分易挥发、易降解，抑菌而不杀菌，因此不易对其它的有益微生物造成危害，改善土壤微生态结构，促进植物与微生物协同进化，保护生态环境，提高中药材或作物的品质。
本发明开辟了降低化学农药施用的新方法，有助于科技工作者对挥发油作用机理的研究，在农业生产中有较广阔的前景；本发明所述降低三七病害发生的佛手挥发油具有投入低、操作简单、效率高、易挥发、低毒、低残留的特点；在国家大力发展有机农业的大背景下，佛手发油是比较理想的克服三七病害的化学药剂替代品，对农业的可持续发展具有重要意义。
附图说明
图1是本发明佛手挥发油及其他化合物对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）和毁坏柱孢霉（Cylindrocarpon destructans）菌落生长的影响结果（菌落直径）；其中a为γ-松油烯；b为d-柠檬烯；c为γ-松油烯+d-柠檬烯；d为佛手挥发油；e为阴性对照（含有体积浓度1%的DMSO和体积浓度0.1%的吐温80的水溶液）；f为粉唑醇；g为恶霉灵；
图2是是本发明佛手挥发油及其他化合物对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）和毁坏柱孢霉（Cylindrocarpon destructans）菌落生长的影响结果（抑菌率）；
图3为三七的发病率和病情指数；A为连作土壤种植的三七；B为含有0.3mg/g佛手挥发油的连作土壤种植的三七。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：佛手挥发油的制备
（1）在300 g粉碎的佛手粉末中加粉末质量8倍水，浸泡2 h，采用加热蒸馏的方式，利用水蒸气提取公丁香中的挥发油，提取时间为6h，冷凝收集溜出液；
（2）提取出来的挥发油用无水硫酸钠干燥，除去所含水份，放进棕色样品瓶里，密封，-20℃保存待用。
实施例2：致病菌的活化
（1）分离三七根部的根腐病致病菌，纯化鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）和毁坏柱孢霉（Cylindrocarpon destructans），将菌种接种到PDA培养基上进行活化，接种4次后，取生长旺盛的菌株备用；
（2）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。
实施例3：GC-MS测定佛手挥发油的化学组分
（1）GC条件：仪器型号：Agilengt Technologies 7890B-5977B；色谱柱：HP-5MS 30 m ×250μm×0.25μm；
（2）EI源电离源温度：230℃；四级杆温度：150℃；扫描范围：30~500m/z；进样口温度：285℃；分流比10 :1；进样量：1 μl；电子能量：70eV；柱温箱升温程序：50℃保持4min，5℃/min 升温至120℃，1℃/min 升温至180℃，10℃/min 升温至280℃保持16min；其中RI值根据正构烷烃连续碳（C9-C25）的保留时间计算得到，将化合物的保留时间和质谱与NIST 17.L数据库进行数据比对，确定最终化合物，检测结果见下表；
a：保留时间；b：相对峰面积±相对偏差；c：保留指数。
实施例4：测定佛手挥发油对实施例2中3种致病菌菌丝生长的影响
（1）在无菌操作条件下，每个培养皿中倒入15mL PDA培养基，待冷却凝固后，取上述实施例2中在PDA培养基上培养7 d的致病菌，用直径5 mm的打孔器沿菌落边缘打取菌块，接种于培养基中央；
（2）将4个无菌牛津杯距离真菌块25mm处等距离放置；
（3）将上述实施例1干燥后的佛手挥发油用含有体积浓度1%的DMSO和体积浓度0.1%的吐温80的水溶液溶解，制得浓度为50mg/mL佛手挥发油；
（4）每个牛津杯加入200μL步骤（3）的50mg/mL佛手挥发油液体（事先用0.22 μm有机系滤头过滤除菌），于微生物培养箱中28℃恒温培养，以不加挥发油的含有体积浓度1%的DMSO和体积浓度0.1%的吐温80的水溶液和恶霉灵为对照，每个处理设5个重复；
（5）培养箱中培养7d后，采用“十字交叉法”测量菌落直径；
结果见图1、2，从图1、2中可以看出公丁香挥发油对3种致病菌的菌丝生长有明显的抑制作用，且与化学药剂恶霉灵的效果相当，其中对腐皮镰刀菌、毁坏柱孢霉的抑菌效果好于恶霉灵。
实施例5：佛手挥发油MIC测定
（1）将实施例1佛手挥发油含有体积浓度1%的DMSO和体积浓度0.1%的吐温80的水溶液溶解，用二倍稀释法配置浓度范围为75-0.15mg/mL的多个浓度梯度液体，阳性药恶霉灵、单体化合物d-柠檬烯和γ-松油烯用同样方法配置成浓度范围为2.5-0.005 mg/mL的浓度梯度；
（2）实施例2中生长7d的病原菌，用20 mL1/4PDA液体培养基（不添加琼脂）冲洗培养基，制成孢子浓度为 1×104个/mL的孢子悬浮液；
（3）在96孔板中加入0.22 μm微孔滤膜过滤除菌的50 μL挥发油和150 μL步骤（2）中制成的孢子悬浮液；
（4）阴性对照为50μL含有体积浓度1%的DMSO和体积浓度0.1%的吐温80的水溶液和150 μL步骤（2）中制成的孢子悬浮液；阳性对照为150 μL步骤（2）中制成的孢子悬浮液；
（5）96孔板28℃恒温培养36h，然后检查孔内真菌生长情况；在595nm处用酶标仪（Thermo 1510）测量每个孔的吸光度，结果见下表；
注：同一行不同字母表示不同处理有显著性差异 (P < 0.05)。
实施例6：佛手挥发油与恶霉灵相互作用测定
（1）依据实施例5得到的佛手挥发油和恶霉灵的MIC，配置成最高浓度为8倍MIC，然后采用二倍稀释法配置8个稀释梯度；
（2）将不同浓度的佛手挥发油（25μL）和不同浓度的恶霉灵（25μL）组合添加在96孔板内，然后每个孔中加入实施例5步骤（2）中制成的孢子悬浮液（150μL）；
（3）150 μL实施例5步骤（2）中制成的孢子悬浮液和含有体积浓度1%的DMSO和体积浓度0.1%的吐温80的水溶液为阴性对照；
（4）96孔板在28℃恒温保存36h，在595nm处用酶标仪（Thermo 1510）比色，检测真菌生长情况；
（5）联合用药的MIC测定：以无真菌孔生长对应的药物浓度作为佛手挥发油与恶霉灵联用的MIC；
（6）FIC计算：挥发油的FIC=挥发油与恶霉灵联用的MIC/挥发油的MIC，恶霉灵的FIC=挥发油与恶霉灵联用的MIC/恶霉灵的MIC；
（7）FICI=挥发油的FIC+恶霉灵的FIC，其中FICI≤0.5为协同作用，0.5<FICI≤1为加和作用，1<FICI≤4为无关作用，FICI>4为拮抗作用，结果见下表；
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实施例7：佛手挥发油对三七体外发病率的抑制实验
按0.3mg/g的比例将佛手挥发油拌入连作土（连续种植三年以上的三七连作土）中放置一周，使二者充分混合均匀后，将健康三七苗直接移栽至混合有佛手挥发油的连作土中；同时以不添加佛手挥发油的连续种植三年以上的三七连作土栽种健康三七苗作为对照；
每组种植80株三七，种植30天以后，根据植株的枯萎程度进行等级划分：0为无发病症状；1为部分叶片萎蔫；2为所有叶片表现出萎蔫的症状；3为茎表现萎蔫的症状；4为叶片和茎都表现出萎蔫症状。
发病率和病情指数按以下公式计算：
发病率=(发病株数/总株数)×100%；
病情指数= 100×∑（各级发病株数×相应等级）/（调查总株数×最高级代表值）；
实验结果见下表及图3，从图中可以看出将挥发油添加到连作土壤中，能降低三七根腐病的发病率和病情指数，且由于挥发油的易挥发性、芳香避秽的特点，本发明挥发油安全、有效；
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