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多花黄精有效成分与主要环境因子的相关性

花匠小妙招
2024-09-23 04:46

百合科Liliaceae植物多花黄精Polygonatum cyrtonema是中药材黄精的基源物种之一，根茎入药，又名姜形黄精。始载于《雷公炮炙论》，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等传统功效[1]。多花黄精根茎中的主要化学成分包括多糖和甾体皂苷。多糖具有免疫调节、降血糖、抗衰老、抗化学性肝损伤、保护痴呆小鼠海马区线粒体结构等活性，甾体皂苷具有降血脂、抗病毒、改善记忆障碍等作用[2-3]。黄精为常用中药材，是药食同源物种，可作为临床配方、中成药生产、保健食品配伍及药膳原料使用。由于市场需求量的增加、资源蕴藏量的减少等原因，黄精价格逐渐上涨，但其引种驯化、丰产栽培技术尚不成熟，目前药材仍主要来源于野生[4]。多花黄精广泛分布于浙江、江苏、安徽、江西、福建、四川、贵州等地，浙江省为多花黄精的主产区之一，种质资源丰富[2]。本研究通过种质资源收集、质量评价、主要有效成分质量分数与生态环境因子的逐步回归分析和相关性分析，为多花黄精的种源筛选、品种选育，规范中药材生产质量管理(good agricultural practice of medicinal plants and animals，GAP)提供研究基础，为黄精资源的可持续利用提供科学依据。

1. 材料

1.1 试验材料

不同种源的多花黄精根茎供试品来自浙江、安徽、湖北等地，采样点信息见表 1。利用《中药材产地适宜性分析地理信息系统》(TCMGIS)，基于数字高程模型(digital elevation model，DEM)的多元线性回归插值方法，根据采样点经纬度提取气候、土壤等主要环境因子[5]。种源地采集后选择有芽的根茎，用刀切成有2~3个节的小段进行种植，于浙江省丽水市莲塘区丽水市林业科学研究院中药材种质资源圃栽培1 a，2013年11月收集地下部分(根茎)，60 ℃烘干，粉碎，过60目筛，干燥器保存。

表 1 多花黄精种源采样点气候因子

Table 1. Climatic factors of Polygonatum cyrtonema sites

编号采样点纬度
N/(。) 经度
E/(。) 活动积
温/℃ 年平均
气温/℃ 年相对
湿度/% 年日照
时数/h 年降水
量/mm 7月最
高温/℃ 7月平
均温/℃ 1月最
低温/℃ 1月平均
气温/℃ 1 浙江丽水莲都区 28.45 119.92 5 669.2 22.3 76.4 1 705 1 502 33.2 28.4 3.3 6.3 2 浙江丽水青田县 28.14 120.30 5 674.8 21.4 79.1 1 723 1 538 31.7 27.6 3.7 6.6 3 浙江丽水松阳县 28.45 119.49 5 653.9 22.0 78.1 1 727 1 498 33.0 28.2 2.9 6.1 4 浙江丽水庆元县 27.62 119.07 5 396.7 22.2 79.9 1 665 1 565 32.6 27.1 3.3 6.4 5 浙江丽水龙泉市 28.08 119.15 5 732.8 22.7 79.2 1 695 1 522 33.3 28.1 3.3 6.5 6 浙江金华磐安县 28.94 120.55 4 675.6 19.3 79.7 1 663 1 504 30.0 25.9 0.6 3.6 7 浙江丽水遂昌县 28.52 119.09 4 833.9 21.3 79.1 1 690 1 500 32.2 27.2 1.7 5.0 8 浙江丽水缙云县 28.82 120.26 4 929.1 20.9 78.4 1 731 1 491 32.2 27.6 2.1 4.9 9 浙江丽水景宁县 27.80 119.72 4 524.9 20.1 80.6 1 560 1 588 29.9 25.0 1.4 5.2 10 浙江衢州江山市 28.74 118.62 5 182.4 21.9 78.6 1 752 1 458 33.3 28.5 2.7 5.5 11 浙江台州天台县 29.24 121.06 4 517.1 17.6 80.9 1 591 1 509 28.0 24.0 -1.1 2.1 12 浙江温州文成县 27.87 119.84 3 898.5 19.1 80.8 1 508 1 599 28.7 23.8 0.1 4.2 13 浙江杭州淳安县 29.61 119.05 5 261.8 20.7 78.1 1 806 1 405 32.8 27.9 1.4 4.0 14 浙江湖州安吉县 30.47 119.69 4 896.0 18.7 78.4 1 876 1 365 30.5 26.4 -0.7 2.1 15 浙江绍兴新昌县 29.39 121.10 4 965.6 19.2 79.8 1 746 1 472 30.1 26.2 0.9 3.7 16 安徽池州青阳县 30.64 117.85 5 173.8 20.2 76.4 1 850 1 296 31.9 28.1 1.2 3.5 17 湖北赤壁市 29.73 113.91 5 307.8 21.2 78.7 1 741 1 267 32.9 28.8 1.5 4.31.2 仪器与试药

UV 2500紫外-可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)；DK-S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)；AB104-N电子分析天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司)；SWB5200型超声波清洗仪(上海必能信超声有限公司)。D-葡萄糖、菝契皂苷对照品(中国药品生物制品检定所)；甲醇、无水乙醇、浓硫酸、冰醋酸、香草醛、高氯酸均为分析纯。

2. 测定方法

2.1 总多糖的测定2.1.1 样品溶液制备

取多花黄精根茎粉末0.25 g，精密称定，加入体积分数为80%乙醇150.0 mL，80 ℃水浴回流提取1.0 h，过滤，取滤渣加入蒸馏水150.0 mL，100 ℃水浴回流提取1.0 h，过滤，取滤液定容至250 mL。另精密称取干燥至恒量的D-无水葡糖糖对照品8.3 mg于25.0 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，配制成0.332 g·L-1的对照品溶液，置冰箱中备用。

2.1.2 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL分别至试管中，加蒸馏水补足至2.0 mL，于冰浴中加入体积分数为0.2%蒽酮硫酸溶液8 mL，摇匀，静置至室温，100 ℃水浴10 min后冰浴10 min冷却。以蒸馏水为空白对照，同法操作，在520 nm波长处测定吸光度值。以质量浓度(x)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线，测得总多糖的标准曲线方程为y=1.194 9x-0.012 0，r=0.999(n=6)，线性范围为0.033 2~0.199 2 mg。取同一供试品溶液，按2.1.2操作进行显色稳定性试验，隔0.5 h测定其吸光度值，结果的相对标准偏差为3.25%(n=5)，表明供试品溶液在显色后2 h内稳定。按2.1.1平行制备6份供试品溶液进行重复性试验，测定其吸光度值，结果相对标准偏差为1.54 %，表明试验重复性良好。

2.1.3 样品质量分数测定

样品按2.1.1制成供试品溶液，平行3份，精密吸取1.0 mL至试管中，按2.1.2测定吸光度值，计算其质量分数。

2.2 总皂苷测定2.2.1 样品溶液制备

取多花黄精根茎粉末0.5 g，精密称定，加入甲醇25.0 mL，80 ℃水浴回流提取1.0 h，过滤即得。精密称取干燥至恒量的菝契皂苷对照品2.0 mg，置于10.0 mL容量瓶内，加入甲醇定容，配制成0.2 g·L-1的对照品溶液，置冰箱中备用。

2.2.2 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0.05，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL分别至试管中，加甲醇补足至1.0 mL，100 ℃水浴蒸干，分别加入体积分数为5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，高氯酸溶液0.8 mL，60 ℃水浴20 min，取出后于冰浴中加入冰乙酸5.0 mL，摇匀，室温放置15 min。以甲醇溶液为空白对照，同法操作，在452 nm波长处测定吸光度值。以质量浓度(x)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线，结果总皂苷的标准曲线方程为y=9.718 2x-0.021 7，r=0.999(n=5)，线性范围为0.01~0.20 mg。取同一供试品溶液，按2.2.2操作进行显色稳定性试验，隔0.5 h测定其吸光度值，结果相对标准偏差为2.62%(n=5)，表明供试品溶液在显色后2 h内稳定。精密吸取对照品溶液5份，各0.6 mL，按2.2.2连续测定进行精密度试验，结果相对标准偏差为3.20%，表明仪器精密度良好。按2.2.1平行制备6份供试品溶液，分别测定其吸光度值进行重复性试验，结果相对标准偏差为4.38 %，表明方法重复性良好。

2.2.3 加样回收率试验

精密称取已知质量分数的同一供试品6份各0.25 g，分别加入适量菝葜皂苷元对照品溶液，按2.2.1制成供试品溶液，按2.2.2测定吸光度值，计算回收率为99.3%~104.1%，相对标准偏差为1.63%。

2.2.4 样品质量分数测定

样品按2.2.1制成供试品溶液，平行3份，精密吸取0.1 mL至试管中，按2.2.2测定吸光度值，计算其质量分数。

2.3 数据分析

在Excel 2003统计软件中进行数据处理和表格制作。在SPSS 17.0统计软件中进行单因素方差分析，比较不同种源多花黄精根茎主要有效成分的差异，并进行有效成分与主要环境因子的相关性分析。

3. 结果与分析

3.1 不同种源多花黄精根茎主要有效成分质量分数差异

不同种源多花黄精根茎多糖及皂苷质量分数存在显著差异(P＜0.05)(表 2)，多糖质量分数范围为97.0~363.2 mg·g-1，皂苷质量分数的范围为24.0~62.6 mg·g-1。来自浙江金华磐安县种源的多花黄精根茎多糖质量分数最高，安徽池州青阳县、浙江丽水景宁县和浙江温州文成县次之，浙江丽水莲都区的多糖质量分数最低但皂苷质量分数最高，安徽池州市青阳县和浙江金华磐安县盘峰乡的皂苷质量分数最低。

表 2 不同种源多花黄精根茎多糖和皂苷质量分数

Table 2. Contents of polysaccharides and saponins of Polygonaturn cyrtonema from different provenances (x±s, n=3)

编号种源地多糖/(mg·g-1) 皂苷/(mg·g-1) 1 浙江丽水莲都区 97.0±2.9g 62.6±4.6a 2 浙江丽水青田县 104.4±6.1g 54.0±0.4 b 3 浙江丽水松阳县 153.6±10.8 f 31.9±2.8fg 4 浙江丽水庆元县 210.5±2.3e 32.0±1.6fg 5 浙江丽水龙泉市 210.7±12.4e 40.5±1.7d 6 浙江金华磐安县 363.2±14.2 a 24.1±1.3i 7 浙江丽水遂昌县 143.2±7.1f 41.3±0.7d 8 浙江丽水缙云县 212.1±4.4e 27.1±0.4hi 9 浙江丽水景宁县 300.7±3.0 b 52.7±2.1b 10 浙江衢州江山市 239.1±12.4cd 37.1±3.8 de 11 浙江台州天台县 226.7±9.7 de 47.0±1.4 c 12 浙江温州文成县 299.9±15.9 b 34.3 :1.9 ef 13 浙江杭州淳安县 254.8±8.0 c 27.2±0.7 hi 14 浙江湖州安吉县 214.2±9.9e 46.6±0.4 c 15 浙江绍兴新昌县 217.7±8.9 e 38.1±3.8 de 16 安徽池州青阳县 302.3±11.5 b 24.0±0.2i 17 湖北赤壁市 226.1±12.3de 28.0±2.0 ghi 说明:同一列所注不同小写英文字母表示新复极差测验5%显著水平。

相关性分析表明，多花黄精根茎多糖和皂苷质量分数呈显著的负相关关系(P=0.018)，表明多花黄精根茎中这2类有效成分质量分数均高的种源难以兼得，引种驯化及优良品种选育时需注意多指标综合评价，而临床及生产应用时应根据适应症及质量控制指标进行原料药材的筛选。

3.2 影响多花黄精根茎主要有效成分质量分数的主要环境因子

将12个生态因子分别规定为x1(经度)，x2(纬度)，x3(活动积温)，x4(年平均气温)，x5(平均相对湿度)，x6(年日照时数)，x7(年降水量)，x8(土壤)，x9(7月最高温)，x10(7月平均气温)，x11(1月最低温)，x12(1月平均气温)。设y1为多糖质量分数，y2为皂苷质量分数。

以种源地的生态因子为自变量，17个样品的多糖和皂苷质量分数为因变量，采用逐步回归分析方法，剔除没有显著效应的自变量，建立比较简化和相对准确的多元线性回归方程：y1=66.948-0.000 9 x3(r=0.618，P=0.008)，表明多花黄精根茎中多糖质量分数与活动积温呈极显著(P＜0.01)负相关关系。

由多花黄精根茎中多糖、皂苷质量分数与环境因子的相关系数统计分析(表 3)可知，多花黄精根茎中多糖积累明显与温度有关，包括活动积温(P=0.008)，年平均气温(P=0.038)，7月最高温(P=0.064)，7月平均气温(P=0.075)，1月最低温(P=0.024)，1月平均气温(P=0.037)；而皂苷质量分数与12个生态环境因子均无显著相关性，其积累变异规律有待进一步研究。

表 3 多花黄精根茎2种主要有效成分质量分数与生态因子的相关分析

Table 3. Correlation analysis between contents of 2 kinds of main effective constituents and environmental factors

成分项目经度纬度活动积温年平均气温年相对湿度年日照时数年降水量土壤 7月最高温 7月平均气温 1月最低温 1月平均气温多糖 Person相关性 -0.056 0.217 -0.618** -0.507* 0.328 -0.194 -0.096 -0.185 -0.459 -0.443 -0.545* -0.508* 显著性（双侧） 0.830 0.402 0.008 0.038 0.199 0.455 0.713 0.476 0.064 0.075 0.024 0.037 皂苷 Person相关性 0.349 -0.319 0.117 0.041 0.058 -0.225 0.386 0.050 -0.129 -0.163 0.140 0.231 显著性（双侧） 0.170 0.212 0.654 0.876 0.824 0.386 0.126 0.848 0.622 0.531 0.592 0.372 说明: **表示1%显著水平；*表示5%显著水平。

4. 结论与讨论

本研究建立了以菝葜皂苷元为标准品的多花黄精根茎总皂苷质量分数测定方法；通过对回流提取、超声提取2种提取法，及甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯3种提取溶剂的综合比较，确定了供试品溶液制备的甲醇回流方法；经过方法学考察后，应用于多花黄精种质资源的质量评价。

多花黄精根茎中总甾体皂苷质量分数与总多糖质量分数显著负相关(P＜0.05)。在初生代谢比较旺盛的条件下，多糖大量积累，皂苷、生物碱等次生代谢合成受到抑制的现象在黄芪Astragali radix，石斛Dendrobii caulis等多种中药材中均有出现[6-8]。活动积温是影响多花黄精根茎中多糖积累的最主要环境因子，与多糖质量分数呈负相关关系，表明生长期适当的低温有利于多糖类成分的积累，与低温刺激植物多糖合成与积累的报道相一致[6]。

中药材生长过程中受到适当的逆境胁迫有利于次生代谢产物的积累，气候地理环境变异与中药材化学生态型的形成与分化相关[9]；不同种源药材在同一实验地栽培后测试分析结果表明：因种源特殊环境因子产生的化学生态型变异，具有一定的遗传潜力，有效成分与种源环境和遗传多样性的关联可为中药优良品种的选育提供参考[10-11]。本研究未发现影响皂苷积累的关键环境因子，需要扩大样本量进一步深入研究；多花黄精中高多糖和高皂苷质量分数难以兼顾，在引种栽培、制定育种和遗传改良方案时，要根据具体改良目标权衡考虑。