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MBW复合体及其在调控杨絮发育中的应用

花匠小妙招
2025-05-23 04:15

mbw复合体及其在调控杨絮发育中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及杨树中的mbw复合体 (pdemixta-pdemyc-pdewd40)调控杨絮发育及其应用。

背景技术：

2.杨树(populus spp.)是世界上分布最广、适应性最强的树种。我国杨树栽培主要集中在华北、华中、东北和西北等地区。杨树不仅是重要的速生丰产用材林树种，而且是环境绿化的重要树种；由于其极快的生长速度和良好的细胞壁化学性质，也是第二代生物燃料生产的合适原料；其栖息地适应性强，还可广泛用于生态防护林、三北防护林、农林防护林。其自身的经济价值、生态价值和社会价值体现出的优越性，是其他树种无法具备和取代的。
3.杨树飘絮造成季节性环境污染的问题，成为当前制约杨树产业发展的重要因素。杨树在生殖特征上是雌雄异株，以往选育推广的杨树优良无性系以雌株为主，然而雌株杨树的蒴果生长成熟后，果实开裂产生很多杨絮四处飞扬，而且飞絮持续的时间也很长，通常能达到半个月之久。杨絮的到处散播不仅会造成环境污染，还能让人呼吸道不畅，而且由于其易燃，很容易造成火灾。因此，如何既能发挥杨树强大的生态效益和较高的经济效益，同时又能控制杨树季节性飘絮污染，是当今社会亟待解决的问题。
4.随着杨树的大面积种植，杨絮对环境的污染和社会的危害也日益严重。但是目前杨絮产生的分子机制尚未得到很好的了解。因此，通过研究杨絮的起始发育调控机理，发掘调控其起始发育的关键基因，对于获得不飘絮的杨树新品种具有重要意义。

技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种调控杨絮发育的mbw复合体(pdemixta-pdemyc-pdewd40)。本发明所要解决的另一技术问题在于提供杨絮起始发育的mbw复合体在培育不飞絮杨树新品种中的应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.本发明第一方面，提供了一种mbw复合体蛋白，所述mbw复合体蛋白由蛋白pdemixta、pdemyc、pdewd40相互作用形成。所述的参与杨絮起始发育mbw复合体的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
8.进一步地，所述蛋白pdemixta的氨基酸序列为seq idno.1。
9.进一步地，所述蛋白pdemyc的氨基酸序列为seq idno.2。
10.进一步地，所述蛋白pdewd40的氨基酸序列为seq idno.3。
11.进一步地，所述mbw复合体蛋白的氨基酸末端连接有标签序列。
12.另一方面，本发明提供了一种与所述mbw复合体蛋白相关的生物材料，为下述a1)至a8)中的任一种：
13.a1)编码所述mbw复合体蛋白的核酸分子；
14.a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；
15.a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；
16.a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；
17.a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；
18.a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；
19.a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；
20.a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物。
21.上述生物材料中，所述载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pcambia1301、pgbkt7/pgadt7、pcambia1300-35s-yfpc155、pcambia1300-35s-nyfp173、 pcambia-nluc、pcambia-cluc。同时，还包括为了验证mbw复合体 (pdemixta-pdemyc-pdewd40)三个蛋白之间的相互作用，酵母双杂交实验的重组载体：pgbkt7-pdemixta、pgbkt7-pdemyc、 pgadt7-pdemyc、pgadt7-pdewd40,进行双分子萤光互补实验的重组载体：yfpc155-pdemixta、yfpc155-pdemyc、nyfp173-pdemyc、 nyfp173-pdewd40，进行荧光素酶互补实验的重组载体：nluc-pdemixta、 nluc-pdemyc、cluc-pdemyc、cluc-pdewd40；为了验证mbw复合体功能，转化拟南芥的重组载体pcambia1301-pdemixta。
22.上述生物材料中，所述重组微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。在本发明的实施例中，采用的农杆菌为gv3101。
23.另一方面，本发明还提供了所述mbw复合体蛋白或所述的生物材料在调控杨絮发育或在培育不飘絮杨树新品种中的应用，包括以下步骤：
24.(1)制备mbw复合体(pdemixta-pdemyc-pdewd40)的反义载体、 rnai载体或crispr载体；
25.(2)利用杨树的遗传转化体系，对杨树中mbw复合体 (pdemixta-pdemyc-pdewd40)进行基因表达沉默或基因编辑，使mbw 复合体功能丧失；
26.(3)培育筛选mbw复合体失活的转基因材料，获得雌株不飞絮的转基因杨树新品种。
27.与现有技术相比，本发明的优点在于：
28.本发明首次鉴定mbw复合体(pdemixta-pdemyc-pdewd40)对杨絮起始发育的调控作用，为通过基因编辑技术减缓杨絮对环境的影响，提供可靠的靶基因和理论依据。首先是以杨树pdemixta蛋白为诱饵载体，在杨絮起始发育时期的的雌花芽的酵母文库进行筛选，得到两个互作蛋白pdemyc和pdewd40，三者能够协同互作形成mbw复合体；其次通过酵母双杂体系，双分子萤光互补实验及荧光素酶互补实验验证了三者之间的互作结果；最后把pdemixta基因在拟南芥无毛突变体gl1中过量表达，可以恢复其野生型表型，表明该基因可以促进拟南芥表皮细胞凸起分化为表皮毛。综上，证实了由pdemixta基因驱动的mbw复合体是杨絮起始发育调控的关键复合物，为无絮杨新品种的创制提供了条件和基础支持。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
30.图1为酵母双杂交(y2h)实验以检查mbw复合体 (pdemixta-pdemyc-pdewd40)蛋白
35s-n yfp173载体，将pdemyc和pdewd40(不包括终止密码子)的cdna序列融合到yfp的n末端，生成pdemyc-nyfp和pdewd40-nyfp。将重组载体转入到gv3101农杆菌菌株，将农杆菌细胞重新悬浮在渗透缓冲液(1 0mm mgcl2，10mm mes，ph＝5.6，200μm乙酰丁香酮)中，最终浓度为od600＝0.6-0.8，然后在室温下培养2h。将缓冲液注射到烟草叶片细胞中，对烟草进行瞬时转化。注射后烟草植株在23℃下培养48-72小时，使用蔡司lsm 710共聚焦显微镜(蔡司，oberkochen，德国)观察叶片中的yfp 荧光信号。在分别同时注射了pdemixta和pdemyc、pdemixta和pdewd40、pdemyc和pdewd40的烟草叶片细胞中可以检测到yfp信号(图 2)，表明pdemixta、pdemyc和pdewd40三者互作形成mbw复合体。
40.(3)荧光素酶互补实验验证mbw复合体(pdemixta-pdemyc-pdew d40)蛋白之间的相互作用
41.为了验证mbw复合体调控杨絮起始发育，通过gateway技术(invitrogen)分别将pdemixta和pdemyc基因克隆到pcambia-nluc(n端荧光素酶)，构成nluc-pdemixta和nluc-pdemyc，将pdemyc和pdewd40基因克隆到pcambia-cluc(n端荧光素酶)，构成cluc-pdemyc和cluc-pdewd40。将重组载体转入到gv3101农杆菌菌株，注射到烟草叶片细胞中，对烟草进行瞬时转化。25℃黑暗处理72h后，将荧光素酶底物d-荧光素(1 0μm，il0230，solarbio，usa)喷洒在烟叶表面，反应在黑暗中培养10 分钟。使用双荧光素酶报告分析系统(glomax 20/20luminometer；promega，usa)获得荧光素酶生物发光图像。在分别同时注射了pdemixta和p demyc、pdemixta和pdewd40、pdemyc和pdewd40的烟草叶片细胞中可以检测到荧光素酶的表达(图3)，表明pdemixta、pdemyc和pdewd40三者互作形成mbw复合体。
42.实施例2、mbw复合体核心蛋白pdemixta转拟南芥进行功能研究
43.用于植物转化的拟南芥无毛突变体(gl1)由实验室保存。将拟南芥种子在75％乙醇中表面灭菌30秒，然后在无菌水中洗涤3次，然后在10％n aclo(v/v)中表面灭菌10分钟，然后再次用无菌水清洗6次，然后均匀播种在含有3％蔗糖和0.8％琼脂，ph为5.8的1/2ms培养基中。种子首先在黑暗中于4℃培养3天，以进行春化处理，然后将其移至生长室(22-23℃，1 6h光照/8h黑暗)中进行发芽，将生长约两周的拟南芥幼苗移植到营养钵中，营养土：黑土：珍珠岩：蛭石＝3：3：1：1，在相同条件下(22-23℃，16 h光照/8h黑暗)生长。
44.把构建完成的过表达载体pcambia1301-pdemixta转化到根癌农杆菌gv3101中。进行农杆菌的扩大培养，收集菌体后，用悬浮液(1/2ms+ 0.5％蔗糖)调整浓度到od＝0.8，用于拟南芥的转化实验。拟南芥转化采用花器官浸染法。在突变体gl1的盛花期(生长4周左右)，用配置好的农杆菌悬浮液浸泡花序30s，在生长室暗培养24h，再恢复正常生长条件直至成熟后分株收获种子(t1)。使用含30mg/l潮霉素的ms培养基进行t1 代转基因阳性植株筛选，筛选获得阳性植株移栽到土壤中，放置在生长室 (22-23℃，16h光照/8h黑暗)中进行正常的管理。待幼苗在土壤中生长1 0天时，在显微镜下观察第一片真叶的表皮毛数量。转基因植株的表皮毛恢复正常。使用quanta 200feg扫描电子显微镜(fei，hillsboro，usa) 观察表皮毛分支，pdemixta在gl1突变体中过表达，转基因植株的表皮毛分支和wt一致，均为3个分支。
45.上述结果证实了mbw复合体(pdemixta-pdemyc-pdewd40)对杨絮起始发育的调控作用。可以通过遗传转化技术，用于培育不飘絮杨树新品种。
46.除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在
这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。