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Plant Physiol | 贯穿组学揭示玉米胚乳发育过程自噬扮演重要角色

花匠小妙招
2025-06-07 11:05

贯穿组学揭示玉米胚乳发育过程中的自噬抑制氧化应激并促进线粒体清除

期刊：PLANT PHYSIOLOGY

IF：7.4

发表时间：2023年6月

研究背景

2023年6月，华盛顿大学生物学系Richard D. Vierstra研究团队在PLANT PHYSIOLOGY杂志上发表了题为“Autophagy during maize endosperm development dampens oxidative stress and promotes mitochondrial clearance”的研究论文，利用贯穿组学探究自噬在玉米胚乳发育过程中的机制。

植物利用各种分解代谢途径来回收细胞成分，以促进生存和新的生长，并去除不需要的/异常的蛋白质、膜、甚至整个细胞器，如果允许积累，可能会引起蛋白质毒性应激。

本研究中通过对早期和中期发育期收获的突变体胚乳进行多组学分析，进一步研究了自噬在玉米种子发育中的作用。研究结果证实，自噬突变体对不同发育期胚乳的蛋白质储存和淀粉积累贡献不大，但在成熟过程中对胚乳的生理机能有很大影响。

发现突变体胚乳表现出氧化还原代谢改变、线粒体蛋白超积累和线粒体异常，这表明自噬可以防止氧化应激，并在胚乳成熟时帮助清除功能失调/不需要的线粒体。

取样细则

样本：W22(野生型）； (mu02975)纯合突变体； (mu02196)纯合突变体

取样时间：6-DAP（发育早期）；18-DAP（发育后期）

取样量：30 ~ 50颗自花授粉玉米种子的胚乳

表型指标测定：16 h光照/ 8 h黑暗光周期下进行种子形态测定

研究思路

技术路线

1.贯穿组学表征玉米胚乳在发育早期和后期的变化

为了评估自噬如何影响玉米胚乳发育，作者对授粉后6和18 d （DAP）收集的胚乳进行代谢组、离子组、转录组和蛋白质组的量化分析。选择6 - DAP胚乳是在这个阶段可以研究组织经历快速合胞分裂和细胞化的早期发育，而18-DAP的胚乳在淀粉质胚乳的程序性细胞死亡和种子脱水之前就已经积累了大量淀粉和玉米蛋白。

通过表型及生理指标结果可以发现，当在营养丰富的条件下生长时，来自等位基因的种子形态与野生型群体相比略有缩小(图1A)，令人惊讶的是，突变体样本在6或18 DAP时淀粉和玉米蛋白(最终构成成熟淀粉胚乳的大部分)的积累几乎没有差异 (图1B-E)，但核心自噬因子ATG8和自噬受体NBR1水平均显著升高，尤其是18-DAP (图1F、1G)。这些升高并不伴随着相应mRNA的增加(图1H)，表明突变抑制了胚乳的自噬过程。

图1. 突变虽然减弱了自噬，但不影响玉米胚乳中淀粉和种子储存蛋白的积累

2.自噬对胚乳代谢组和离子组的影响

为了探究自噬对玉米胚乳生理的影响，研究人员进行了基于授粉后6和18天（DAP）收集的胚乳代谢组、转录组和蛋白质组的主成分分析（PCA），结果显示，在两个发育阶段，突变体和野生型之间的所有三个数据集都有明显的分离，而离子组素受基因型的影响最小，其PCA值分离度较低(图2A)。代谢组的深入分析揭示了野生型和突变型胚乳之间存在显著差异，突变分别在6和18 DAP处显著改变了239和247种代谢物的丰度(约占总丰度的55%)(P≤0.05和q≤0.10)(图2B)。通过Pearson相关系数和拟合值，和之间的代谢物变化强度具有良好的相关性，暗示这种差异是由自噬阻断引起的(图2C)。进一步的代谢物聚类热图、GO、KEGG和MetaboAnalyst定义的富集分析、聚类分析显示，在氨基酸、伯碳、磷脂和核苷酸代谢方面存在显著差异。特别是，与抗氧化代谢和应激防御有关的牛磺酸和次牛磺酸在突变体中受到最大影响(图2D)。

图2. 6和18 DAP对玉米胚乳代谢的影响

此外，各种磷脂的差异也很明显，生长素酰胺偶联物吲哚乙酰天冬氨酸在6- DAP处的含量也大幅下降(8.6倍) (图3B)。在18-DAP样品中，代谢物的差异更为明显，这表明随着胚乳成熟自噬突变体在生理层面受到的影响被加剧。在这个发育时期，与谷胱甘肽和抗坏血酸代谢相关的化合物发生了明显的变化(图3A、3B)。大多数受到强烈影响的化合物与硫醇代谢和氧化应激有关，这意味着它们保护胚乳免受活性氧(ROS)的侵害。

图3. 玉米胚乳中受显著影响的特定代谢簇

3.突变改变了胚乳的转录组

热图显示了和突变体与野生型(WT)相比，在6-DAP和18-DAP共有539个差异基因，其中6-DAP样品中有460个，而18-DAP样品中只有91个(图4A和B)，这些差异出乎意料地小(仅占总转录本的1.6%)，这意味着自噬对胚乳基因表达的影响很小。与代谢组学一样，通过Pearson相关系数发现和背景之间的转录本差异具有显著相关性，这意味着作者发现的DEGs确实是由于自噬阻滞引起的(图4C)。值得注意的是，6-DAP和18-DAP样品之间只有12个共有的DEGs(图4B)，这与这些时间点胚乳成熟状态的不同相一致，并且这12个共有的DEGs都与自噬、膜运输或代谢通量有关。

尽管差异基因并不多，但是对于差异基因进行GO富集分析发现，仍有许多GO条目受到突变的影响。在6-DAP，与S—腺苷甲硫胺酸(SAM)、γ-氨基丁酸（GABA）和硫化合物代谢相关的GO 条目增加，但对非生物应激、过氧化物和蛋白质折叠的响应减少，这意味着代谢、氧化还原和蛋白质稳态的动态平衡(图4D)。在18-DAP时，升高的GO条目包括DNA复制和染色体，这表明突变延迟了与胚乳成熟相关的合胞体分裂(图4D)。

对特定转录本的关注揭示了在背景下胚乳表达的信息变化。包括编码蛋氨酸腺苷转移酶(MAT)-1和精胺合成酶(SPMS)-1的mRNA上调，它们分别参与SAM和多胺的生物合成，以及与氮同化和谷氨酸代谢相关的mRNA下调，例如编码谷氨酰胺合成酶(GS)-2和假定的谷氨酸脱氢酶(GDH)的mRNA，这可能是观察到的谷氨酸相关化合物差异的基础(图4E)。

在18-DAP处，编码核糖核苷酸还原酶(RNR)-1和DNA复制复合体70亚基B (RPA70B)的mRNA发生了有趣的变化，这可能再次反映了DNA复制和染色体维持的改变(图4E)。如上所述，ATG8d和NBR1a在6或18- DAP时，野生型和背景之间存在适度的mRNA差异(图1H)，这意味着自噬的阻断并没有在转录上上调这一过程。

图4. 对玉米胚乳转录组有轻微影响

4.自噬强烈影响胚乳蛋白质组

为了确定自噬如何影响胚乳蛋白质组，作者通过label free技术对总组织提取物进行分析，仅包括在至少三个生物重复实验中检测到的蛋白质，确保了数据集的可靠性。与胚乳转录组结果相反，突变对蛋白质组的影响要大得多。通过火山图评估FC的丰度和显著性p值可以看出，在6和18-DAP时，突变体与野生型相比，检测到的蛋白质中有13.4/13.6%和29.1/22.2%显示出显著的丰度差异（图5A)。Pearson相关系数和拟合值显示，和背景的蛋白强度变化具有很强的相关性(图5B)，这清楚地表明这种差异是由自噬阻滞引起的。

在18-DAP时，背景中显著增加的蛋白包括自噬成分ATG8d和NBR1a以及各种细胞器蛋白(图1G、5A)。GO富集分析发现，在6- DAP时，胚乳中的核仁、核糖体、RNA加工和翻译相关事件，以及在18-DAP时，线粒体、核糖核蛋白复合物、蛋白酶体、粗内质网和与这些隔室/复合物相关代谢功能的GO 条目被富集(图5C、5D)。

图5. 玉米胚乳蛋白质组在突变后发生了显著改变

在和野生型数据集中，分别有3,073个和2,700个蛋白质和相关转录本在6和18-DAP时共有。在这些蛋白质和相关转录本中，有很大比例在6和18-DAP时几乎没有变化，分别为75.7%和67.9%。这表明大多数胚乳蛋白质不受转录或自噬的差异调节。尽管如此，作者还是发现了一个较小的群体，其蛋白质水平受到其中一种或两种过程的显著影响。对这部分蛋白质进行分析发现，在6- DAP和18-DAP时与核仁、RNA加工和核糖体相关的蛋白，在18-DAP时与线粒体、蛋白酶体和各种代谢功能相关的蛋白被富集。突变对核糖体和线粒体的影响在特异性绘制时变得更加明显。在背景下，出现了蛋白质水平下降但mRNA没有相应下降的情况，这可能代表其他蛋白水解途径的激活。

图6. 胚乳转录物与蛋白丰度的比较

5.胚乳线粒体蛋白过度积累，线粒体有缺陷

考虑到线粒体可能通过自噬过程在胚乳成熟中被选择性清除，作者使用GO分析了线粒体蛋白质组，以识别该细胞器的独特蛋白质。在18-DAP(205个蛋白质中的90个）和在6-DAP的较小程度上（6%）明显向背景倾斜，这与线粒体在没有自噬的情况下保留一致。尤其是与三羧酸循环、呼吸复合体和ATP合成相关的蛋白质的增加暗示整个线粒体收到了影响（图7A），对于其他几个主要细胞器/复合体的分析也在18-DAP的胚乳中检测到了蛋白质水平的增加，表明它们也是自噬底物。

为了对线粒体进行更深入的分析，作者生成了一个简化的线粒体代谢、转录组学和蛋白质组学图谱，重点关注TCA循环和与氧化呼吸（I至IV）和ATP合成（V）相关的蛋白质复合物（图7B）。令人惊讶的是，相关酶的增加与mRNA的趋势不一致（图7C），这表明一种调节代谢物流动的稳态机制(图7B)。综上所述，很明显，整体自噬的缺乏破坏了胚乳中线粒体的蛋白质平衡。

作者推测在胚乳中观察到的线粒体蛋白的较高水平将随着线粒体数量的增加而增加。为了验证这一点，作者用透射电镜测量了在20-DAP下收获的胚乳中线粒体的数量和面积。与预期相反，在细胞学上发现胚乳中的线粒体数量和面积都更少(图7E)，并且发现了异常数量的异常线粒体，嵴扩张/异常，在管腔内被视为电子半透明区域(图7D、7E)。因此推测，胚乳聚集了功能失调的线粒体，这些线粒体过度积累了常驻蛋白。

图7. 玉米胚乳线粒体及其蛋白质组受到自噬的影响

6.自噬影响抗氧化和硫醇代谢

在突变下，与氧化还原代谢相关的代谢物显著增加，表明突变胚乳可能经历氧化应激。为了深入探索这一可能性，作者全面研究了氧化还原代谢，特别关注了谷胱甘肽/活性氧(ROS)相关途径和半胱氨酸代谢（图8A）。在胚乳中，抗坏血酸水平降低，脱氢抗坏血酸增加，可能是由于APX水平上升所致（图8A-C）。尽管脱氢抗坏血酸水平较高，但GSH和GSSG水平很低，暗示谷胱甘肽合成可能失调或消耗增加。

此外，除了抗坏血酸和谷胱甘肽，植物还采用其他机制来解毒HO和ROS。葡萄糖酸盐和半乳糖酸盐水平显著增加（图3A、3B），PRX还原酶和硫氧还蛋白还原酶水平也增加，这可能是为了解毒HO和ROS。但在野生型和突变体中测量的过氧化氢酶蛋白水平相似，表明其活性不能解释突变体胚乳中氧化还原差异(图8A)。

预测氧化还原-硫醇代谢的变化可能会改变胚乳中ROS的积累，使用Amplex Red试剂测量了胚乳提取物中的HO水平(图8D)。在野生型胚乳中，HO水平从6到18-DAP上升了约3倍，这意味着随着胚乳成熟，氧化应激增加。令人惊讶的是，虽然和突变体的胚乳在6-DAP时具有与野生型相似的HO水平，但在18-DAP时积累的HO较少(少40%)，这表明这种氧化剂被胱氨酸、葡萄糖酸盐和半乳糖酸盐等最终产物消耗(图3B、8A、8B)。

图8. 突变改变玉米胚乳氧化还原代谢

迈维小结

作者通过对胚乳的贯穿组学分析揭示了营养组织的复杂发育历史，它利用自噬来减少氧化应激并维持细胞稳态，最终转变为静止的储存组织。由于其可能的部分功能是调节线粒体、过氧化物酶体、质体、内质网、核糖体和蛋白酶体的水平，因此研究完全成熟的种子，以检验自噬在细胞死亡前管理淀粉胚乳生物学方面具有重要性。确定与自噬相关的胚乳发育瓶颈可能会揭示提高玉米籽粒质量和产量的机会。

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