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Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

花匠小妙招
2025-06-24 05:27

Summary

在这里, 我们提出了一个研究植物生长行为的协议, 特别是表型以可重现的方式。我们展示如何提供可变和在同一时间稳定的光条件。正确的分析取决于足够的样本数和有效的统计评价。

Abstract

植物生物学家经常需要观察他们所选择的物种的生长习性。为此, 植物需要恒定的环境和稳定的光条件, 这是最好的数量和质量变量, 以便在不同的设置可以进行研究。这些要求由具有发光二极管 (LED) 灯的气候室满足, 它可以与荧光灯形成不同的波长。发光二极管是能量守恒, 即使在光强度下也几乎不发出热量, 这通常构成了其他光源的问题。该协议提供了一步一步的指导, 如何规划一个气候室装有可变 LED 灯, 以及描述几种方法, 深入分析的增长表型。根据试验装置的不同特性, 可以观察和分析生长中的植物。在这里, 我们描述了如何确定新鲜的重量, 叶面积, 光合活性和气孔密度。我们证明, 为了获得可靠的数据和得出有效的结论, 必须使用足够数量的个人进行统计评估。用太少的植物进行这种分析会导致高的统计误差, 因此对数据的解释不太清楚。

Introduction

Protocol

此协议包含一些示例, 说明如何分析A. 南芥植物的生长行为。

1. 准备

在开始之前, 仔细计划一下需要多少种植物来进行实验的可靠统计分析, 然后准备适当数量的花盆。
注意: 总是允许一些种子可能不会发芽。使用不同的单独可编程 LED 水平的气候室来比较在相同的一般环境条件 (材料表) 下的植物生长。

2. 植物生长和 LED 灯的设置

准备适当的数量 (取决于不同的条件和/或突变体要分析) 的 6 x 7 cm 盆与土壤和植物在每一个单一的种子。
注: 在这种情况下, 每种条件下播种了36株植物。Vernalize 在4° c 的两天。设置相对湿度为 65%, 温度为22° c/16 ° c, 为16小时/8 小时夜间循环。将所有级别的光照调整为200µM/cm2/秒1的强度。通过在高潮室前面的触摸屏上输入相应的值进入一个程序来做到这一点。要比较四种不同的光源质量, 将指示灯设置为以下参数, 如表1所示。 Identifyier395毫微米 [%]440毫微米 [%]3 K [%]660毫微米 [%]770毫微米 [%] 阳光”1001110015100 红色和蓝色 (RB)100152510100 蓝色 (B)1001525225 红色 (R)9022510100

表 1: 发光二极管发出的光强度的组成

连续监测频谱输出,例如使用内置校准光谱仪。把植物放在气候室的不同层次上, 并保持它们覆盖在一个透明的顶端, 直到发育良好的子叶可见。确保植物充分浇水。根据植物在所选择的条件下的生长速度, 每两天对植物进行眼部和摄影的监测和记录. 确保使用三脚架为相机, 以确保相机和对象之间的相同距离的所有图片, 从而使比较。适当时使用缩放栏。
注: “DAS” 一词 (播种后的天数) 指的是种子的实际种植, 包括春。

3. PSII 产量的测定

使用脉冲调制 fluorimeter。设置在适当的距离从植物的相机头, 使完整的玫瑰花可以看到在现场的窗口。启动软件时, 将出现 “选择设备” 窗口。勾选 “迷你”, 然后 “ok”。在下一个弹出窗口中选择颜色 “蓝色”。单击 “确定”。
注: 脉冲调制荧光测量灯自动开启。在显示器上, 图像窗口显示荧光参数 Ft。放置在照相机下的植物现在可以被看作是橙色的图像。要集中图像和/或选择特定区域的植物, 切换到现场视频的滴答作响的 “现场视频” 框, 并打开调整环的物镜。单击右上角的 “退出” 框, 退出 “实时视频” 窗口。为了测量光合参数, 定义一个感兴趣的区域 (君)。使用默认设置, 它是一个自动出现在屏幕中间的圆圈。它旁边的红色方框代表了所有像素的平均 Ft 值。通过从右侧面板的 “从” 框中选择相应的形式来定义适当的君。单击 “添加” 选项卡, 并在叶区域内放置圆圈。每叶重复五次。在制造商提供的默认值 (表 2) 中维护设置 (右侧的选项卡)。光国际.频率11 法.光国际.宽度80 图像校正迷你 图像转换电池16.7V 获得5 阻尼1 Sat 脉冲国际.不间隔 s8130 慢感应延迟 s时钟 s持续时间 s4020315 Absortivity红色增益红色强度近红外强度3402513 显示颜色 PS 限制50 肼.Ref. 君1 调频因数 (刻度)1030

表 2: 由制造商提供的 PAM 测量的默认设置。

应用饱和光闪光进行光合参数的荧光猝灭分析 (饱和状态脉冲) 测量。在此之前, 通过测量暗适应植物的最小和最大荧光率来确定淬火系数。为此, 将植物放在黑暗中 (如在抽屉或黑盒子里的), 使其处于最小值。然后把植物放在相机头下, 检查盒子的测量和 ML (测量光), 在下面的行中选择 “Fv/fm”, 通过计时进入圆圈, 并点击 Fo, 调频在屏幕的底部。
注意: Fo/Fm 代表了一个暗适应的植物的 PSII 产量。因此, 应用光后测量的值是归一化的。当前的 Fo/Fm 测量将保持直到新的记录被激活。由饱和脉冲决定的所有 F 和 fm 的值与 Fo/调频和淬火参数进行了相应的计算。在 “报表” 选项卡中查找这些结果, 并检查与实验相关的所有右侧框 (e. g。Y (II),/qn,等)。将结果导出到分析软件e. g。Excel 通过单击左上角的 “导出” 按钮并保存在相应的文件名下。生成至少五 AOIs 每叶和测量同一个植物的几个叶子 (不要忘记对短期黑暗适应植物在每次测量以后), 并且几棵植物从一个情况, 可以然后统计地被评估。为统计分析产生平均值和标准偏差从所有 AOIs 和至少三独立植物为所有时间点或情况并且执行学生的 t 测试评估数据是否是重要的12。当 p 值低于0.05 时, 将对数据进行显式不同的计算。

4. 气孔密度的测定

在玻璃培养皿中收集三个完全膨胀的玫瑰花叶, 每个条件为70% 乙醇, 提取叶绿素。在室温下或在4° c 贮存时, 在该溶剂中孵育。为充分清除从颜料, 孵育在水合氯醛溶液中 (水合氯醛: 水: 甘油 = 8: 2: 1 瓦特/伏/w) 直到叶子出现完全白色。在40X 放大倍数下, 取背面表面的差分干涉显微镜 (DIC) 图像。计数气孔在视野和外推的帮助下规模酒吧的气孔每毫米。对每个条件至少4叶重复此步骤。通过计算一个条件下的所有叶的平均值来进行统计分析, 并由此计算平均误差。

5. 鲜重的测定

去除所有叶子包括叶柄从六棵植物的花环与刀片的每个条件。立即称量所有叶子, 并按照上述数据进行统计分析。

6. 玫瑰叶面积的测定

使用图片从八植物每个条件分析叶面积图形。将图片合并为单个图像中的一个条件, 然后另存为 *. jpeg 或 *. tiff。下载相应的软件 (材料表)。
注意: 当然, 可以应用任何其他能够执行此任务的程序。打开一个图像文件。选择工具 “自由手选择”。包围叶包括一个莲座丛的叶柄。单击 “分析-设置测量” 并检查 “区域”、”最小 & 最大灰度值”、”集成密度” 和 “平均灰度值”。选择适当的小数位, 最好是两个或三, 然后单击 “确定”。若要获取 mm2而不是像素, 请使用 “设置比例” 命令。应用直线选择工具使行选择与已知距离相对应,例如从图像的刻度栏轻松计算的离开直径, 然后打开 “设置比例” 对话框, 然后输入此定义的距离和单位测量.然后返回 “分析”, 然后单击 “测量”。出现一个新窗口, 标题为 “结果”, 其中包含当前花环的相关数据。重复此过程与所有植物在图像和初始化面积测量为每一个新的工厂与 ctrl+ m。
注: 对于具有非重叠叶子的较小的植物, 可以使用 “魔杖工具” 使过程变得更容易、更快。一旦树叶开始互相覆盖, 这个工具就不会给出可靠的结果。或者, 切断所有的叶子, 并把它们放置在一个概述图片可以采取的方式, 然后使用魔杖工具。考虑到使用这种方法时, 需要更多的植物。在 “结果” 窗口中选择 “文件”-“另存为”, 并在计算机目录中生成适当的文件名和位置。该文件将以 Excel 格式自动保存。

7. RNA 的准备

每种情况下从十株植物中收获三样品。根据制造商的说明, 使用植物 rna 提取试剂盒提取总 rna。使用 bioanalyzer 测定 RNA 的浓度、纯度和完整性。然后, RNA 可以用于下游应用, 如 qRT PCR 或基因表达分析, 由如RNASeq13。

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Climatic chamber equipped with LED panelsRhenac Green Tec AGThese chambers are custom made.Spectrometer OceanOpticsUSB-650Imaging PAMWalzIMAGING-PAM M-SeriesThere are several suitable models depending on the broader use.Microscope+ 40x objectiveLeica DM1000Other companies also produce suitable microscopes.Software ImageJFree download from websitePlant RNA extraction kitQiagen74903BioanalyserAgilentG2939BANeeds an additional computer