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JACS：花菁染料的功能化设计提升生物分子示踪和细胞内成像性能

花匠小妙招
2025-07-27 20:15

导读

近日，美国国家癌症研究所Martin Schnermann研究团队在功能化花菁染料的合成与应用方面取得新进展，相关研究成果以“Method To Diversify Cyanine Chromophore Functionality Enables Improved Biomolecule Tracking and Intracellular Imaging”为题发表在Journal of the American Chemical Society上。本文利用吡啶苯并噁唑（PyBox）作为七甲川吲哚菁染料的合成前体，以此制备了两种高产率、易修饰的近红外（NIR）荧光分子。作者利用迭代方法将分子用于蛋白质靶向的肿瘤成像当中。与传统NIR荧光团相比，优化后的探针与肿瘤的特异性结合能力增强。此外，通过调整分子中的亲电/亲核基团，作者还设计了环化的七甲川吲哚菁染料，并利用极性影响的开环/闭环反应提升了分子对细胞的吞噬率和荧光性能。该研究为花菁荧光团的功能化修饰开阔了视野，同时也推动了NIR探针在先进光学成像领域的发展。文章链接DOI: 10.1021/jacs.3c01765。

正文

近红外（~ 700-900 nm）荧光成像凭借组织穿透深、成像速度快、副作用小等优点引起了研究人员的广泛关注。其中，七甲川吲哚菁染料作为NIR成像探针而备受青睐。尽管如此，该染料在部分生物应用方面仍受限。比如，现有的探针染料在体内成像时可能会改变生物大分子的功能，而生物大分子表面染料-染料相互作用也会影响探针的荧光信号。而自标记蛋白标签的策略又不适用于细胞渗透性较差的七甲川吲哚菁染料。Figure 1A为最常用的环酮衍生物的Vilsmeier-Haack合成染料的方法，但是面临着取代产率较低等不足。因此，七甲川吲哚菁染料在合成以及性能调控方面仍存在不足。近期有报道利用2,4-二硝基芳基吡啶盐（即Zincke盐）作为七甲川吲哚菁染料的合成前体（Figure 1B）。下载化学加APP到你手机，更加方便，更多收获。

本文中，作者将PyBox引入到七甲川吲哚菁的合成当中（Figure 1C），调控C4′-位上的基团可实现分子的高产率多功能取代，并且优化后的探针可完成对蛋白靶向的肿瘤成像。利用七甲川吲哚菁可调的环化反应，作者进一步证明了高渗透性的探针可用于细胞内成像。

Figure 1.（A，B）已报道和（C）本文中的七甲川吲哚菁染料的取代基修饰方法（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

实验中，作者通过将醋酸钠、未取代的PyBox在乙醇溶液中加热反应15 min后可得高产率的母体菁染料3a（Figure 2A），PyBox中间体可被用来修饰不同极性的官能团以及脂肪族、芳基和杂芳基取代的多种花菁库。接下来，作者又测试了七甲川吲哚菁染料在甲醇溶液中的吸收/发射光谱（Figure 2A-C），并将其吸收波长与σm进行作图（Figure 2B）。数据表明，分子中吸电子基团的存在会使吸收波长发生红移。此外，消光系数（ε）与波长则不成相关性（Figure 2C），而亮度则表现出明显的特征。以上结果说明，C4′-位上取代基团的不同可导致菁类染料光物理性能的差异。

Figure 2. （A）C4′-位不同取代基的近红外七甲川吲哚菁染料的光学表征；（B）m与λabs的关系曲线；（C），（D）亮度（× ΦF）与λabs的关系曲线（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

接下来，作者利用PyBox合成方法制备了性能增强的七甲川吲哚菁染料，并将其用于靶向生物大分子。通过在C4′-位上偶联羧酸4a、伯胺4b、丙酸4c等基团而制备了一系列七甲川吲哚菁靶向染料（Figure 3A）。作者测试了该系列染料在PBS缓冲液中的光学性能。杂环衍生物4g-4i展现出可观的亮度，苯基羧酸（4d-4f）衍生物则具有较大的摩尔消光系数和近红外发射特征（Figure 3B，C）。同时，作者将EGFR-靶向的单抗Panitumumab（Pan）与染料偶联得到Pan-4d, Pan-4e和Pan-4f。在注射168 h后，Pan-4e和Pan-4f表现出高肿瘤摄取率和肿瘤/背景比（Figure 3D，E）。

Figure 3.（A）PEG3-磺化的C4′-位取代的七甲川吲哚菁系列染料;（B），（D）亮度（× ΦF）与λabs的相关性；（D）Pan-4d，Pan-4e和Pan-4f注射到肿瘤小鼠模型168 h后的TBRs；（E）48 h注射后的小鼠体内荧光图像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

尽管如此，Pan-4e和Pan-4f仍需要大量的NHS酯用于偶联mAb。为此，作者首先设计合成了FNIR-Tag-766（Figure 4A），并测试了Lumi-Cy7（商用非磺化七甲川吲哚菁），IR-800CW（过磺化衍生物）和FNIR-Tag-766在PBS溶液中的光学性能（Figure 4B）。FNIR-Tag-766与IR-800CW的λabs，ΦF和ε相似，相比于Lumi-Cy7则表现出红移。作者又验证了FNIR-Tag-766是否可用于偶联mAb，Pan与FNIR-Tag-766的偶联物未表现出明显的H聚集或者蛋白聚集的现象（Figure 4C）。作者还对比了Pan-FNIR-Tag-766，Pan-IR-800CW和Pan-Lumi-Cy7的体内成像性能，Pan-FNIR-Tag-766展现出最高的肿瘤信号（Figure 4D，F）。Pan-FNIR-Tag-766的TBR值与Pan-Lumi-Cy7相当，但是LBR值较低（Figure 4G，H）。体外荧光实验表明Pan-Lumi-Cy7和Pan-IR-800CW展现出较高的荧光信号，但在肝脏、肺、肾脏、肠和脾中也有非特异性聚集（Figure 4E）。经Pan-Lumi-Cy7，Pan-IR-800CW和Pan-FNIR-Tag-766处理的肿瘤流式细胞分析数据说明，相比于Pan-Lumi-Cy7和Pan-IR-800CW，Pan-FNIR-Tag-766对hEGFR+细胞的摄取明显高于mCD45+细胞（Figure 4I）。

Figure 4.花菁类染料用于蛋白靶向的肿瘤成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者又测试了FNIR-Tag-766作为纳米抗体的靶向潜力（Figure 5），偶联纳米抗体（7D12）的探针7D12-FNIR-Tag-766在小鼠体内可以保持较高的荧光信号和较好的肾脏代谢效率。

Figure 5. 7D12-FNIR-Tag-766在肿瘤小鼠体内的成像性能表征（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者又利用花菁染料可调的环化特性考察了探针的细胞内成像能力（Figure 6），并以此合成了极性依赖特性的环化染料3I。通过引入不同基团，得到了化合物8a-c，其中，三氟乙基取代基化合物的荧光量子产率较高。

Figure 6.（A）化合物3I, 8a-c的中的内酯/内酰胺-两性离子平衡；（B）化合物3I在MeOH-d4和 THF-d8 中的部分氢谱；（C）MeOH + 0.1% TFA中七甲川吲哚菁的光学性能；（D）化合物3I, 8a-c在水-二氧六环中的最大吸收波长-介电常数的关系曲线（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

HaloTag是一种被广泛应用的自标签技术。作者制备了含/不含三氟乙基取代基的化合物9a和9b，同时也制备了相应的羧酸9c和甲酯9d作为非环化对照（Figure 7A）。将9a与HaloTag室温孵育3 h后，探针的吸收强度和荧光强度分别展现出24倍和200倍的提升（Figure 7B）。同时，相比于化合物9b-9d，化合物9a展现出较低的背景荧光和较高的选择性（Figure 7C，D）9a/9c-HaloTag在U-2 OS细胞中的半衰期为60 s，并且光漂白程度较小（Figure 7E）。此外，9a还取得了良好的细胞内标记成像效果（Figure 7F）。

Figure 7.环化菁染料用于细胞内成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结

美国国家癌症研究所Martin Schnermann研究团队探究了利用七甲川吲哚菁染料的动态开环/闭环化学反应实现长波长发射探针的可能性。同时，所发展的高细胞穿透性的靶向探针有望应用于NIR外科手术当中，以此提升细胞内成像性能。通过在分子中修饰关键基团的策略，拓宽了菁类染料的探针分子库，也将更有利于促进NIR成像技术的发展。

文献详情：

Syed Muhammad Usama, Sierra C. Marker, Dong-Hao Li, Donald R. Caldwell, Marcus Stroet, Nimit L. Patel, Alison G. Tebo, Sophie Hernot, Joseph D. Kalen, Martin Schnermann*. Method To Diversify Cyanine Chromophore Functionality Enables Improved Biomolecule Tracking and Intracellular Imaging. J. Am. Chem. Soc. 2023 , https://doi.org/10.1021/jacs.3c01765