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从柑橘落果中提取天然活性产物的方法

花匠小妙招
2025-09-01 08:29

专利名称：从柑橘落果中提取天然活性产物的方法
技术领域：
本发明属于植物天然产物的提取技术领域，具体涉及一种从柑橘生理落果中连续提取天然活性产物如辛弗林、橙皮苷和柠檬苦素等活性产物的方法。
背景技术：
柑橘属在分类学上为芸香科(Rutaceue)柑橘属(Citrus)植物，为世界的第一大水果，2005年世界柑橘产量达到1亿多吨，中国约为1500万吨，仅次于巴西和美国(叶兴乾，柑橘加工与综合利用.北京中国轻工业出版社，2005，12-15 ；李建敏等，联合提取柑桔皮中精油、色素、果胶和橙皮苷.生物质化学工程，2007a，41(1) :22-24) 0我国柑橘种质资源丰富，是世界许多柑橘种类的原产地，世界各国的许多柑橘品种最初都引自我国。目前，中国柑橘品种仍然以宽皮柑橘为主，约占总种植面积的阳％，甜橙占30%，柚子占10%，其它柑橘类占5% (田世英，我国柑橘产业基本情况及发展思路，中国农业信息，2004( -J)。柑橘属容易成花，但座果率较低，一般为3% 5%，丰产树可达10%左右，低产树通常不到 1% (钟云等，柑橘落花落果的原因及防止措施，广东农业科学.2006 C3) :62-63)。柑橘各种类品种间，落果、落花、落蕾比例不同，宽皮橘类是以落果为主，占落花落果总数的83% _97%，而橙类是以落蕾落花为主，占落花落果总数的69% -77%。柑橘落花落果严重，座果率低，是一普遍现象。其幼果由于生理原因凋落为生理落果。生理落果有两个明显的高峰期，柑橘落果从调查的数据看，其第一次生理落果在5月上中旬(即花谢后1-2周)，幼果从果梗(花梗与枝的结合部)处脱落，落果的数量多，约占总落果量的 73%-99%，时间短而集中；第二次落果高峰期出现在6月上旬，幼果枯黄后从蜜盘(子房基部和果蒂之间)处脱落，至6月下旬以后生理落果才基本停止，但落果的果实较大，约占总落果量的0. 02%-27% (李玲等，赣中南柑橘果实生长发育规律与栽培技术关系，长江流域资源与环境，1998，7 (4) =359-363 ；胡国元，柑桔落花落果与使用生长调节剂的研究初报，湖南农业科学，2003 (3) 43-44)。目前，对柑橘加工废弃物的研究越来越受到人们的重视，对柑橘皮渣利用的主要途径之一就是围绕其所含成分的提取而展开的，如从中提取香精油、色素、果胶、类黄酮、膳食纤维等。柑橘果渣的另一个主要利用途径就是利用微生物发酵，如生产果醋、乳酸饮料、高蛋白饲料和栽培食用菌(乔海鸥等，柑橘皮的综合利用，浙江柑橘，2003，2(K2) :31-35 ；叶兴乾，柑橘加工与综合利用，中国轻工业出版社，北京，2005，12-1 。而对于柑橘的生理落果的利用，人们的重视程度还不够。生理落果是柑橘果实发育过程中的一种正常现象。在发展柑橘生产中，从栽培到收获都会有大量的落花、落果及残、次果实。在保花保果的同时，生理落果及蔬果依然占很大比重。柑橘的落花落果的资源很容易被人忽视。如果充分利用柑橘的落果以及蔬果，就能充分保证其中有效成分的提取和利用，将对有效保护环境，提高柑橘综合利用价值有重大意义。同时，将落果提取后的残渣进行营养成分分析，用微生物发酵制备饲料或肥料，可以最大化提高落果的综合利用率。柑橘落果资源的充分利用，不仅可以促进柑橘栽培业的发展，也可为制药等行业提供丰富的原料(周鸣谦等，不同品种柑橘落果的药用成分研究，湖南农业大学学报(自然科学版)，2008，34(4) :438-441)。我国对柑橘落果的利用，主要是单一提取柠檬酸或者橙皮苷，对落果的利用还不够充分，部分企业有意从单一提取逐步向综合利用转变，如果能连续从柑橘落果中提取辛弗林、橙皮苷、柠檬苦素类似物等有效成分，将会大大提高对柑橘落果的综合利用，并推动我国柑橘产业的发展。我国柑橘种植面积广阔，落果资源丰富，因而成为具有工业化生产价值的原料。现有工艺都只对利用落果中某一成分进行了研究，落果中其它成分得不到充分的利用，造成很大的浪费。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种从柑橘生理落果中连续提取天然活性产物如辛弗林、橙皮苷和柠檬苦素的方法。本发明通过下列技术方案实现一种从柑橘生理落果中连续提取天然活性产物辛弗林、橙皮苷和柠檬苦素的方法，其步骤包括(1)将柑橘落果清洗干净，于80°C下烘干后粉碎过20-100目分析筛，得到预处理柑橘落果粉；(2)称取2. 0-3. Og步骤⑴的预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1 40-1 50，于 40-50°C水浴中加热回流他，挥干石油醚后，再于100-105°C下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；C3)将步骤( 得到的脱脂柑橘落果粉按重量/体积比为1 10-1 50加入浓度为50-90%的乙醇，40-80°C下回流提取l_3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；(4)将步骤(3)所得的浓缩液按体积比为1 2-1 3加入氯仿结晶后，加水分层，水层直接加热到75V，趁热过滤，加0. lmol/L的盐酸调节pH至3_4进行沉淀，得到橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；(5)将步骤(4)所得的氯仿层溶液旋干，按体积比为1 2-1 3加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50°C，真空度为SOOmmHg干燥条件(采用DZF-6021真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司生产)下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；(6)将步骤(5)所得的结晶过滤后的丙酮溶液旋干，按体积比为1 2-1 3加入二氯甲烷溶解，过滤，将得到的二氯甲烷溶液按体积比为1 2加入异丙醇，混勻后在4°C下结晶得到柠檬苦素粗品；(7)将步骤(4)、(5)、(6)所得的三种活性成分粗品，用高效液相色谱仪(HPLC)进行定性和定量分析。其中步骤(6)所述的柠檬苦素HPLC定性条件为检测波长210nm ；流动相乙腈/水 =45/55 (ν/ν)；流速1. OmL/min ；柱温室温；进样量10 μ L ；橙皮苷HPLC定性条件为检测波长280nm ；流动相水乙腈四氢呋喃乙酸体积比为80 16 3 1 ；流速 1. OmL/min ；辛弗林HPLC定性条件为检测波长:225nm ；流动相乙腈水磷酸体积比为 32 68 0.2，内含0.2g十二烷基磺酸钠(SDS)/IOOmL ；流速1. OmL/min;柱温室温。
作为优选方法之一，上述方法中的步骤(1)的前处理原料的最佳粉碎粒径为过 60目分析筛，步骤(3)的回流温度是60_75°C，脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量体积比为 1 40-1 55，乙醇的浓度为45-60%，共计提取3次，每次提取时间为池。作为优选方法之二，所述的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量体积比为1 50，所述乙醇的浓度为50%。乙醇的回流温度为70°C。本发明较好的解决了现有技术存在的缺陷，现有工艺主要是从柑橘落果中单一提取柠檬苦素或者橙皮苷，只对落果中某一活性成分进行了研究，而落果中其它活性成分的利用还不够充分，造成很大的浪费。本发明从柑橘落果中连续提取辛弗林、橙皮苷、柠檬苦素类似物等有效成分，将会大大提高对柑橘落果的综合利用价值，并将推动我国柑橘产业的发展。

图1 本发明的柑橘生理落果有效成分提取的总工艺流程图。图2 不同粒径下活性成分的提取率。图3 提取温度与活性成分提取率的关系。图4 提取时间与活性成分提取率的关系。图5 提取固液比与活性成分提取率的关系。图6 提取浓度与活性成分提取率的关系。图7 提取次数与活性成分提取率的关系。图8 橙皮苷液相色谱图及紫外图谱，其中图8_a为橙皮苷标准品的液相色谱图及紫外图谱，图8-b为样品中橙皮苷的液相色谱图及紫外图谱。图9 辛弗林高效液相色谱图及紫外图谱，其中图9_a为辛弗林标准品的液相色谱图及紫外图谱，图9-b为样品中辛弗林的液相色谱图及紫外图谱。图10 柠檬苦素高效液相色谱图及紫外图谱，其中图10-a为柠檬苦素标准品的液相色谱图及紫外图谱，图10-b为样品中柠檬苦素的液相色谱图及紫外图谱。
具体实施例方式实施例11、实验材料以80°C烘干粉碎脐橙(品种为朋娜，一个中国南方广泛推广的优质脐橙品种，朋娜脐橙落果来自湖北省松滋市望春花果汁有限公司柑橘园)的第一次生理落果和第二次生理落果的果实。2、实验方法(1)将脐橙落果清洗干净，于80°C下烘干后粉碎过50目分析筛，得预处理柑橘落果粉；(2)称取3. Og预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1 40，于40-50°C水浴中加热回流他，挥干石油醚后再于100-105°C下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；(3)将步骤⑵所得的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量/体积比为1 30，乙醇浓度为70%，于60°C下回流提取l_3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；(4)将步骤C3)所得的浓缩液按体积比为1 2加入氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75V，趁热过滤，再用0. lmol/L的盐酸调节pH至3_4进行沉淀得橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；(5)将步骤(4)的氯仿层溶液旋干(RE52-99型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产，按照仪器说明书操作)，按体积比为1 3加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50°C，真空度为SOOmmHg条件下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；(6)将步骤(5)的结晶过滤后的丙酮溶液旋干(RE52-99型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产，按照仪器说明书操作)，按体积比为1 2加入二氯甲烷溶解，过滤，将获得的二氯甲烷溶液按体积比为1 2加入异丙醇，混勻后在4°C下结晶得到柠檬苦素粗品。实施例2按照实施例1的基本步骤。脐橙来源同实施例1.(1)将脐橙落果清洗干净，于80°C下烘干后粉碎过20目分析筛，得预处理柑橘落果粉；(2)称取3. Og预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1 40，于40-50°C水浴中加热回流他，挥干石油醚后再于100-105°C下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；(3)将步骤(2)所得的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量/体积比为1 10，乙醇浓度为90%，于40°C下回流提取l_3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；(4)将步骤C3)所得的浓缩液按体积比为1 2加入氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75V，趁热过滤，再用0. lmol/L的盐酸调节pH至3_4进行沉淀得橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；(5)将步骤(4)的氯仿层溶液旋干，按体积比为1 3加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50°C，真空度为SOOmmHg条件下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；(6)将步骤(5)的结晶过滤后的丙酮溶液旋干，按体积比为1 2加入二氯甲烷溶解，过滤，将获得的二氯甲烷溶液按体积比为1 2加入异丙醇，混勻后在4°C下结晶得到柠檬苦素粗品。实施例3按照实施例1的基本步骤。脐橙来源同实施例1.(1)将柑橘落果清洗干净，于80°C下烘干后粉碎过100目分析筛，得预处理柑橘落果粉；(2)称取2. 0-3. Og预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1 40，于50°C水浴中加热回流他，挥干石油醚后再于100-105°C下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；(3)将步骤⑵所得的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量/体积比为1 50，乙醇浓度为50%，于80°C下回流提取l_3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；(4)将步骤C3)所得的浓缩液按体积比为1 3加入氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75°C，趁热过滤，再用0. lmol/L的盐酸调节pH至3_4进行沉淀得橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；(5)将步骤(4)的氯仿层溶液旋干，按体积比为1 2加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50°C，真空度为SOOmmHg条件下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；(6)将步骤(5)的结晶过滤后的丙酮溶液旋干，按体积比为1 2加入二氯甲烷溶解，过滤，将获得的二氯甲烷溶液按体积比为1 2加入异丙醇，混勻后在4°C下结晶得到柠檬苦素粗品。实施例4按照实施例1的基本步骤。脐橙来源同实施例1。1、实验材料以80°C烘干粉碎处理朋娜脐橙落果，得到预处理柑橘落果粉。2、实验方法2. 1柑橘落果粉碎最佳粒径的确定以朋娜脐橙第一次生理落果为原材料，于80°C烘干粉碎，分别过20目、40目、60 目、80目和100目分析筛，分别精确称取0. 5g朋娜脐橙落果粉，先用料(未脱脂柑橘落果粉)液(乙醇)比为1 30的60%浓度的乙醇在70°C下回流提取池，将滤液混合，用蒸馏水定容至50mL，利用高压液相色谱法(HPLC)测定柑橘落果提取物中辛弗林，柠檬苦素和橙
皮苷含量。含量测定直接用高效液相色谱测定柠檬苦素、辛弗林及橙皮苷的浓度。再按下列公式计算各自提取率提取率(μ g/mg) = CXV/W(式中C为样品液浓度；V为体积W为原料重)。结果如图2所示。由图2可见，随着粒径的变小，总的提取率是逐渐增大的。但在 60目过后，增加的幅度已经很小了，且有下降趋势。故柑橘落果原料在60目粒径下三种活性成分均达到较高提取率，确定柑橘落果粉的碎粒径为60目为最佳实施方式。2. 2柑橘落果复合提取前脱脂与否的确定以80°C处理下朋娜脐橙的两次生理落果为原料进行活性成分的提取，比较原料脱脂与否对活性成分得率的影响。利用HPLC分别测定提取物中辛弗林，柠檬苦素和橙皮苷的含量。称取2. 0-3. Og柑橘落果粉，置于已称重的滤纸筒内，将滤纸筒封好后放入索氏抽提器内。连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为 1 40-1 50，于40-50°C水浴中加热回流8h，挥干溶剂后再于100-105°C下干燥，得到脱脂柑橘落果粉。由表1可见，脐橙的两次生理落果的果实脱脂后效果不同，第一次生理落果的果实脱脂后，三种活性成分(辛弗林，柠檬苦素和橙皮苷)的提取得率均有不同程度的减少；第二次生理落果脱脂后，辛弗林的得率减少，橙皮苷和柠檬苦素脱脂后得率反而提高了。因此生产实践中可专门针对脐橙第二次生理落果的果实进行脱脂处理。表1柑橘落果粉是否脱脂对活性成分提取率的影响
权利要求
1.一种从柑橘落果中提取天然活性产物的方法，其步骤包括(1)将柑橘落果清洗干净，于80°c下烘干后粉碎过20-100目分析筛，得预处理柑橘落果粉；(2)称取2.0-3. Og预处理柑橘落果粉，置于索氏抽提器内，连接已恒重的蒸发烧瓶，加入石油醚，预处理柑橘落果粉与石油醚的重量/体积比为1 40-1 50，于40-50°C水浴中加热回流他，挥干石油醚后再于100-105°C下干燥，得到脱脂柑橘落果粉；(3)将步骤(2)所得的脱脂柑橘落果粉与乙醇按重量/体积比为1 10-1 50，乙醇浓度为50-90%，于40-80°C下回流提取l_3h，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇，得浓缩液备用；(4)将步骤C3)所得的浓缩液按体积比为1 2-1 3加入氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75°C，趁热过滤，再用0. lmol/L的盐酸调节pH至3_4进行沉淀，得到橙皮苷粗品，回收氯仿层溶液；(5)将步骤(4)的氯仿层溶液旋干，按体积比为1 2-1 3加入丙酮，使辛弗林结晶，在温度为50°C，真空度为SOOmmHg条件下得到辛弗林粗品，回收结晶过滤后的丙酮溶液；(6)将步骤(5)的结晶过滤后的丙酮溶液旋干，按体积比为1 2-1 3加入二氯甲烷溶解，过滤，将获得的二氯甲烷溶液按体积比为1 2加入异丙醇，混勻后在4°C下结晶得到柠檬苦素粗品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的预处理柑橘落果粉的粉碎粒度为50-70目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤( 所述的回流温度为60-75°C，所述的脱脂后的柑橘落果粉与乙醇的重量/体积比为1 40-1 50，乙醇的浓度为52-60%，每次提取时间为池。
4.根据权利要3所述的方法，其特征在于，步骤( 所述的回流温度为70°C，所述的脱脂柑橘落果粉与乙醇的重量/体积比为1 50，所述乙醇的浓度为50%。
全文摘要
本发明属于柑橘天然产物提取技术领域，具体涉及从柑橘生理落果中连续提取天然活性产物如辛弗林、橙皮苷和柠檬苦素的方法。采用干燥后粉碎至20-100目的柑橘落果为原料，按重量/体积比1∶10-1∶50加入50-90％的乙醇在40-80℃下回流提取1-3h，过滤，滤液回收乙醇，得浓缩液备用；将该浓缩液加入少量氯仿结晶后，加水分层，将水层直接加热到75℃，过滤，加0.1mol/L的盐酸调节pH至3-4进行沉淀得橙皮苷粗品；将所得的氯仿层溶液旋干，加入适量丙酮结晶，真空干燥得辛弗林粗品；将结晶过滤后的丙酮溶液旋干，加入二氯甲烷溶解，过滤，按体积比1∶2向溶液中加入异丙醇，结晶得柠檬苦素粗品。利用高压液相色谱法对所得三种活性产物进行了定性和定量分析，其中以橙皮苷的纯度最高，为91.41％。
文档编号C07J73/00GK102442916SQ20101051208
公开日2012年5月9日申请日期2010年10月1日优先权日2010年10月1日
发明者徐晓云, 徐永霞, 毛华荣, 潘思轶申请人:华中农业大学