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Plant Physiol | 浙江大学胡璋健团队番茄抗旱机制研究新进展

花匠小妙招
2025-09-06 07:27

干旱，这一自然现象，对农业产生了深远的影响。作为人类生存和社会发展的基础，农业的稳定与繁荣直接关系到我们的食物安全和经济发展。然而，干旱作为一种常见的自然灾害，经常给农业生产带来严重的影响，甚至导致粮食减产、生态环境恶化等一系列问题。

2024年3月2日，Plant Physiology在线发表了浙江大学题为“Phosphorylation of sugar transporter TST2 by protein kinase CPK27 enhances drought tolerance in tomato”关于番茄抗旱的相关研究，研究基于在其他物种中被广泛研究的基因CPK27开展，该基因的功能虽然在其他物种中研究较多，但是该基因会由于表达模式、亚细胞定位、底物特异性和转录后修饰等方面的调控差异，在不同植物物种中的分子和生化特性存在很大差异，因此本文通过代谢组学和蛋白组、磷酸化蛋白组对番茄中该基因参与的功能进行研究。迈维代谢为本研究提供了糖类的检测服务。

研究结果快速导读

敲除CPK27降低了番茄植株的耐旱性，并损害了脱落酸（ABA）调控的植物对干旱胁迫的反应。蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学结果显示，依赖CPK27的干旱诱导蛋白与糖代谢途径高度相关，干旱条件下突变体可溶性糖含量降低进一步证实了这一点。通过蛋白相互作用和磷酸化评估证明了CPK27直接与tonoplasast Sugar Transporter 2（TST2）相互作用并磷酸化，促进干旱胁迫下细胞间可溶性糖的积累。此外，Ca和ABA增强了CPK27介导的相互作用和TST2的磷酸化，从而揭示了TST2在番茄植株抗旱性中的作用。这些发现提供了通过操纵CPK27介导的可溶性糖积累来提高植物抗旱性的思路，从而使植物在不断变化的气候条件下具有抗旱性。

研究背景

当遭受水分亏缺时，植物在短短几秒钟内就表现出细胞质Ca水平的快速飙升。这种现象经常引起细胞内级联的适应性反应，包括蛋白激酶的激活、脱落酸（ABA）合成的启动、渗透物（如脯氨酸、可溶性糖和多胺）的积累、气孔关闭和转录重编程的协调。尽管Ca信号在植物抗旱性中的作用已经被证实，但仍有许多悬而未决的问题。

钙依赖性蛋白激酶（CPKs）是一类独特的钙感应蛋白，具有钙读取和反应的双重作用。钙感知和响应在CPK中的整合使钙信号直接转化为磷酸化事件，促进快速和精确的细胞反应。越来越多的证据表明，CPK参与ABA信号的转导，调节植物对各种环境挑战的适应，特别是对渗透胁迫的适应。但是由于在表达模式、亚细胞定位、底物特异性和转录后修饰等方面的调控差异，CPK亚型在不同植物物种中的分子和生化特性存在很大差异。

面对干旱胁迫，植物战略性地积累可溶性糖，这种现象被认为在增强植物干旱胁迫中起着关键作用。通过维持细胞膜完整性、调节渗透压和增强保水能力来提高耐水性。番茄是全球最杰出的蔬菜作物，然而番茄生产面临着水稀缺性的威胁，据观察这将使产量减少50%至70%。本篇内容中作者将对CPK27在赋予番茄耐旱性方面的积极作用，以及CPK27功能丧失导致番茄干旱超敏反应进行研究。

研究结果

1.CPK27参与番茄抗旱表型和生理指标测定

①表型和生理指标测定：突变体呈现明显的干旱表型和生理指标变化

为了表征CPK27在抗旱性方面的生理功能，使用CRISPR-Cas9构建了CPK27突变体的两个纯合子系（和）。在不浇水约10天后，与野生型（WT）相比，两种敲除系都表现出严重的叶片卷曲和萎蔫迹象。与WT相比，分离的叶片的失水率更高，从而导致其叶片表面温度更低。在缺水4 d后，干旱胁迫叶片的水势与对照相比进一步下降。在不浇水10天后，突变体的蒸腾速率有所下降，但仍显著高于WT对照植株。此外，在品系中，干旱诱导的电解质泄漏显著增强。综上所述，CPK27正调控番茄植株抗旱性。

②嫁接实验：CPK27调控抗旱性的功能主要取决于茎部性状

根与芽之间复杂的相互作用，通常被称为根与芽之间的沟通，在增强植物抗旱性方面起着关键作用。为了研究CPK27在根和芽之间交流中的作用，作者在突变体和WT幼苗之间进行了反向嫁接。有趣的是，WT/（接穗/砧木）植株表现出与WT自嫁接植株相似的耐旱性，而/WT嫁接植株表现出与自嫁接植株相似的严重萎蔫表型（图1A）。与上述结果一致的是，失水试验表明，/WT和自嫁接植株的离体叶片失水速度快于WT/和WT自嫁接植株（图1B）。此外，与WT/嫁接植株相比，/WT嫁接植株出现了干旱诱导的表型，包括叶片温度升高、蒸腾速率加快、水势降低和电解质泄漏增加（图1C-F）。综上所述，CPK27调控抗旱性的功能在很大程度上取决于茎部性状。

图1.嫁接植株表型及生理指标测定

③外源ABA处理：突变体中ABA诱导的相关基因表达下降和气孔关闭受损

考虑到ABA在调控植物对干旱胁迫的反应中所起的关键作用，评估CPK27对ABA介导的抗旱性的影响。令人印象深刻的是，外源ABA处理显著提高了WT植株在断水10天后的耐旱性，但基于严重的萎蔫表型，ABA未能从干旱胁迫中拯救突变体。同时ABA处理并没有减少干旱诱导的突变品系的电解质泄漏。此外检测ABA信号转导基因ABA响应元件结合因子1和4 （AREB1, ABF4）， ABA不敏感3和5 （ABI3, ABI5）在不同基因型中的转录丰度，发现在所有情况下，突变体与WT对照植物相比，ABA诱导的表达显著降低。在干旱胁迫条件下，ABA介导的气孔运动在缓解水分流失中起着关键作用。为了验证CPK27在ABA介导的气孔运动中的潜在作用，通过气孔孔径测定来检测不同基因型的气孔对ABA的响应。值得注意的是，ABA诱导的气孔关闭在突变体中受损。这些结果表明，CPK27可能是调节ABA介导的抗旱性的一个重要信号组成。

2.蛋白组和磷酸化蛋白组揭示CPK27介导的抗旱性与糖代谢过程有关

①蛋白组和磷酸化蛋白组测定

为了研究CPK27在植物抗旱反应中的作用，对WT植株和突变体分别在3 d的正常和干旱处理下的30 d龄番茄叶片进行定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。与突变体对干旱处理的敏感表型一致，主成分分析（PCA）表明，干旱处理的突变体的蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱与干旱处理的WT不同。比值≥2或≤0.5和p值< 0.05的蛋白或磷酸化位点被鉴定为差异表达。对于定量蛋白质组学分析，在4649个定量蛋白质中，有476个蛋白质在突变体中具有不同的丰度，其中407个蛋白质在突变体中与WT植物相比减少，69个蛋白质在突变体中有富集水平（图2A）。此外，磷酸化蛋白质组学分析显示，在突变体中，共有9673个量化磷酸化肽，涵盖3234种蛋白质，有18771个量化磷酸化位点，其中来自251种不同蛋白质的386个磷酸化位点表现出磷酸化富集，来自237种不同蛋白质的344个磷酸化位点相对于WT植物表现出磷酸化降低（图2B）。

②差异蛋白分析：突变体中鉴定到更多的干旱诱导和抑制蛋白

接下来，鉴定了WT和植物之间的干旱相关蛋白差异。在突变体中检测到570个干旱诱导蛋白和580个干旱抑制蛋白，而在WT植物中仅检测到240个干旱诱导蛋白和347 个干旱抑制蛋白（图2C）。在干旱诱导蛋白中，其中122个在WT植物中明确存在，而不是在突变体中（图2D）。对122个依赖于CPK27的干旱诱导蛋白进行GO富集分析，发现前5个通路与“应激响应”、“水响应”、“缺水响应”相关（图2E）。此外对GO通路进行了分类，发现CPK27介导的抗旱性与缺水（GO:0009414、GO:0009415、GO:0009269和GO:2000070）、碳水化合物代谢（GO:0005975和GO:0051156）、ABA信号传导（GO:0009738, GO:0071215）和解毒（GO:0098869, GO:0097237, GO:1990748, GO:0098754, GO:0009636）高度相关（图2F），显示了CPK27调控的潜在干旱胁迫响应途径。

③差异磷酸化蛋白分析：CPK27相关的磷酸化蛋白显著富集单糖和己糖分解代谢过程

磷酸化蛋白质组数据显示，干旱处理诱导突变体646种蛋白质的1066个磷酸肽磷酸化状态，然而在WT植物中，只有586种蛋白质的903个磷酸肽表现出干旱富集的磷酸化水平（图2G）。在这586个干旱诱导的磷酸化蛋白中，只有285个在WT植物中表现出磷酸化水平的富集，被认为是CPK27相关的磷酸化蛋白（图2H）。在这285个蛋白中，磷酸化的氨基酸大部分是丝氨酸（76.00%），其次是219个苏氨酸（21.32%），而磷酸化酪氨酸占了定量磷酸化位点的2.78%。此外，这285个蛋白中有69.66%包含一个磷酸化位点，19.02%包含双磷酸化，4.27% 包含三磷酸化，7.05%包含三个以上磷酸化位点（图2I）。此外，其中8个包含超过5个磷酸化位点，如氧化还原调节蛋白（Redox-Regulatory Protein）、Tonoplast Sugar Transporter （TST2）和Basic Helix-Loop-Helix （BHLH）转录因子（图2J）。对磷酸化蛋白质组学数据进行了基序分析，在这285 个磷酸化蛋白中发现了两个保守的磷酸化丝氨酸基序。GO富集分析表明，这285个磷酸化蛋白显著富集在单糖分解代谢过程和己糖分解代谢过程（Fold富集> 25,FDR < 0.05）（图2K）。

图2.蛋白组和磷酸化蛋白组结果初步分析

3.干旱诱导的可溶性糖积累在突变体中被中断

①GC-MS糖测定：突变体可溶性糖含量显著下降

根据定量蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据集得出的GO富集结果，推测CPK27介导的抗旱性很可能依赖于糖代谢过程。接下来通过糖代谢谱来研究干旱诱导的可溶性糖积累是否在突变体中被中断。绝大多数（25/19）可溶性糖在干旱处理下显著富集，而在突变体中，干旱诱导的15种糖的水平被显著抑制（图3A）。

蔗糖、葡萄糖和果糖是最丰富的可溶性糖。在甘露醇处理12 h后，这三种可溶性糖在番茄植株中不断增加（图3B-D）。然而，这些渗透胁迫诱导的可溶性糖的积累在突变体中很大程度上受到抑制，特别是在12 h时蔗糖和24 h时葡萄糖的积累（图3B-D）。

②外源可溶性糖处理：蔗糖、葡萄糖和果糖可以减少突变体水分流失

为了确定添加可溶性糖是否能抑制水分流失，将离体叶片真空浸润，在不同可溶性糖或dHO中孵育1 h，擦干后测定水分流失。不同可溶性糖类型和dHO对照处理后，WT叶片水分损失率无显著差异（图3E-J）。有趣的是，与dHO对照处理相比，施用蔗糖、葡萄糖或果糖后，突变体叶片脱水5小时后，水分损失率大幅降低（图3E-G）。然而，与dHO对照相比，棉子糖、阿拉伯糖醇、半乳糖，水分损失率都是不变（图3H-J）。

图3.突变体和WT中糖变化情况测定

4.CPK27调控胞浆糖转运蛋白TST2

①酵母双杂交：CPK27特异性地与TST2和TST3相互作用

为了更好地解析CPK27介导的抗旱性的潜在分子机制，以CPK27的激酶结构域（CPK27VK）为诱饵进行了酵母双杂交（Y2H）筛选。在90个潜在候选蛋白中，TST2编码的液泡糖转运蛋白（Solyc04g082700）被确定为潜在的CPK27相互作用蛋白。有趣的是，在磷酸化蛋白组中，TST2也被归类为干旱诱导的CPK27相关磷酸化蛋白。值得注意的是，番茄基因组有三个不同的基因编码番茄液泡糖转运体:TST1 （Solyc03g032040）， TST2和TST3 （Solyc04g082700）。为了进一步验证CPK27和TST之间的特异性相互作用，将三个TST亚型用作点对点Y2H检测的猎物。结果表明CPK27特异性地与TST2和TST3相互作用，而不是与TST1相互作用（图4A）。在TST同源物中，TST3的转录丰度最低。因此，TST2作为后续相互作用验证的代表性靶点。

②GST/BIC/Co-IP实验：CPK27以Ca/ ABA依赖的方式与TST2相互作用

GST下拉实验表明，CPK27在体外与TST2细胞质部分（TST2cyt）有很强的相互作用（图4B）。在番茄原生质体中进行了BIC分析，进一步证实了CPK27-TST2相互作用复合物定位在原生质体膜上（图4C）。在植物中，Co-IP实验进一步证明，在外源Ca或/和 ABA处理下，CPK27和TST2的相互作用强度增强（图4D）。综上所述，这些结果表明CPK27以Ca/ ABA依赖的方式与TST2相互作用。

图4.CPK27与TST2互作实验

③突变体表型及生理指标测定：TST2正调节植物的抗旱性，并且是干旱诱导的可溶性糖积累所必需的。

为了进一步研究TST2在植物抗旱反应中的作用，对突变体及其WT对照植株进行了干旱处理。然而，在断水约10 d后，突变体表现出比WT对照植株更明显的叶片萎蔫，蒸腾速率更快，水势更低。正如预期的那样，没有干旱胁迫的突变体的可溶性糖含量相对于WT植株下降了约20%，而在干旱暴露9 d后，这一下降幅度扩大到33%以上。这些发现提供了令人信服的证据，证明TST2正调节植物的抗旱性，并且是干旱诱导的可溶性糖积累所必需的。

5.CPK27对TST2的磷酸化是促进番茄抗旱性的必要条件

磷酸化蛋白质组学数据表明，TST2属于干旱诱导的磷酸化蛋白。在抗TST2抗体免疫沉淀后，使用抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体进行免疫印迹进一步验证了这一结果，在缺水8 d内，TST2的磷酸化水平逐渐富集（图5A）。

磷酸化蛋白质组学数据显示，CPK27的功能丧失抑制了TST2的磷酸化，而在突变体中，干旱诱导的TST2磷酸化也在很大程度上受到抑制（图5B）。作为一种典型的激酶，CPK27具有直接磷酸化大多数与其相互作用的底物的能力。通过Phos-tag迁移率移位实验，提供了CPK27在体外磷酸化TST2的证据。然而，当犊牛肠道碱性磷酸酶（CIAP）存在或CPK27的激酶死亡变体（His-CPK27）存在时，TST2的这种磷酸化信号被有效消除（图5C）。此外，Ca或/和ABA 可以进一步促进体内CPK27介导的TST2磷酸化（图5D）。根据磷酸化蛋白质组学分析的结果，干旱处理导致TST2的特定残基磷酸化，包括Ser-313、Thr- 372、Ser-393、Ser-444和Ser-445（图5E），其中Ser-445位点在所有拟南芥和番茄TST基因以及棉花GhTST2中都是保守位点，这表明它可能是不同植物物种之间的关键位点。为了确定CPK27介导的TST2磷酸化位点，对体外磷酸化重组TST2蛋白进行LC-MS/MS分析。仅鉴定出三个磷酸化肽，证明TST2的Thr-372、Ser-393和Ser-444位点被CPK27直接磷酸化。这三个Thr和Ser转化为Ala的突变TST2 （TST2）很大程度抑制了其被CPK27磷酸化，而包含所有五个Thr和Ser转化为Ala突变的TST2变体（TST2）几乎失去了其被CPK27磷酸化（图5F）。

图5.TST2的磷酸化位点研究

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