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一种美丽百合花药愈伤组织的诱导方法与流程

花匠小妙招
2025-09-09 21:17

本发明涉及园艺科学领域，尤其涉及一种以美丽百合的花药为外植体高效诱导愈伤组织的方法。

背景技术：

百合是百合科百合属所有种、亚种、变种、变型和品种的统称，是以观花为主的具有重要商业价值的球根花卉，其形态特征为多年生草本，株高70~150厘米，鳞茎卵形或近球形，先端常开放如莲座状，由多数肉质肥厚、卵匙形的鳞片聚合而成；叶通常散生，较少轮生；花常有鲜艳色彩，有时有香气。目前全球已发现的百合品种至少有120个，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区。我国是百合属植物的故乡，具有悠久的百合栽培历史。百合花素有“云裳仙子”之称，有心心相印、百年好合、清纯高雅等寓意，观赏价值高，自古以来就深受人们喜爱，如今已经成为绿化美化和切花生产的主要花卉，市场需求量十分巨大。

美丽百合（学名liliumspeciosum）又名鹿子百合、艳红百合。原产中国江西省、浙江省、台湾，及日本九州。株高60~100厘米。叶对生，宽而疏，故名大叶百合。茎上部开花数朵，花瓣向外反卷，雄蕊露出花瓣之外，花白色和淡红色，花瓣上布有玫瑰色花纹和斑点，状如鹿身上的斑纹，故有鹿子百合之美名。花色白者，称白鹿子百合，花色红赤或紫者，叫赤鹿子百合。中国台湾的珍稀品种艳红鹿子百合，被称为“东亚最美丽的百合花”。美丽百合由于品种名贵，观赏价值极高，近年来颇受人们喜爱，具有广阔的市场前景。

美丽百合的繁殖方式有播种繁殖、扦插繁殖和分球繁殖。播种繁殖属有性繁殖，一般育种周期长，从种子播种到开花要经历较长时间，因此主要在培育新品种上应用。目前商业上美丽百合主要采用扦插和分球的方式来进行无性繁殖。这种方法的优点是育种时间短，能大量繁殖而且能保持品种特性，但长期的无性繁殖会使病毒在植株体内积累，引发百合病毒病，致使其品质逐渐下降，往往一些优良性状得不到很好的传代而丢失。有报道称通过分球繁殖的百合其病毒病发病率可达到40%-50%，严重影响百合的观赏品质，从而影响百合的经济效益。因此，研究百合的脱毒技术，生产无病毒苗，成为百合种球商品化所面临的一个重要问题。

自20世纪50年代发现通过植物组织培养可以除去病毒以来，该方法在生产上被广泛应用，并在此基础上衍生出了热处理法脱毒、茎尖分生组织培养脱毒、抗病毒化学药剂脱毒、低温处理脱毒以及花药培养脱毒等技术，目前，在百合脱毒生产上应用最广的是热处理、茎尖组织培养和添加抗病毒化学药剂以及三者相结合的方法，关于这些方面的专利和文献报道屡见不鲜。但是这些方法都有一定的不足之处，例如用热处理方法对百合脱毒需将感染病毒的百合种球用35~38℃热空气处理4~5周或者更长时间进行脱毒，长时间的热处理不仅影响百合存活率而且脱毒效率也不高；茎尖分生组织培养脱毒法的要求较高，剥离的茎尖应尽可能小，茎尖越小脱毒效果越好，但同时也会产生褐化、玻璃化等现象，严重影响了百合的成活率；抗病毒化学药剂脱毒通常也需要与茎尖分生组织培养结合起来应用，单独使用不能达到很好的效果。

低温处理脱毒是基于超低温保存对细胞的选择性破坏的原理，结合组织培养和病毒检测技术达到脱毒的目的，但这种方法对实验条件要求很高，目前还不适用于百合商业生产。花药培养脱毒的原理是花药培养可产生来源于花粉的单倍体植株，而且花粉小孢子基本不携带病毒，通过花药培养培育的植株脱毒率几乎能达到100%，而且还可以省去病毒鉴定的程序，若是将花药培养应用于百合脱毒无疑是获得百合无病毒植株的最好途径。

目前百合花药培养脱毒技术的应用还处于起步阶段，获得成功的案例较少，分析其原因发现主要是现有的百合花药培养效率较低，具体表现为愈伤组织诱导率低，愈伤组织分化时白化苗率高，因而通过花药培养得到的百合实用栽培品系非常少。另一方面由于百合属种繁多，不同种之间存在较大的基因型差异，现有的成功案例不能适用于所有的百合属种。我们对百合花药培养的特点进行了深入研究，发现培养基是影响花培效率的关键因素，而目前还没有专门适合于美丽百合花药培养的培养基。因此我们进行了大量的试验，在基本培养基的基础上不断调节各组分的用量，并添加不同的可能有益于提高诱导率的物质，终于开发出了一种针对美丽百合花药愈伤组织的诱导培养基及诱导方法，为美丽百合花培脱毒技术的长远发展奠定了物质基础。

技术实现要素：

本发明的目的是针对当前百合花药培养效率较低，并且缺少专门适用于美丽百合花药诱导培养方法的问题，提供了一种高效的美丽百合花药愈伤组织的诱导方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种美丽百合花药愈伤组织的诱导方法，其特征在于，该诱导方法的详细步骤如下：

（1）新鲜花蕾的选取与预处理：

在美丽百合正常现蕾开花季节，选择大部分花药小孢子处于单核靠边期的花蕾，用冰壶带回实验室，用湿润的纱布包裹后置于4℃冰箱中低温预处理2~4d；

（2）花蕾的表面消毒、无菌花药的获得；

美丽百合花蕾低温预处理后，将花蕾用自来水冲洗10~20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精浸泡5min，再用无菌水冲洗干净，然后用无菌滤纸吸干表面水分；于解剖镜下用镊子拨开花蕾取出花药投入0.5%邻苯二甲醛+2-3滴吐温-80的消毒液中浸泡10min，再用无菌水冲洗3~4次后，即获得无菌花药；

（3）无菌花药的接种

在超净工作台无菌条件下，用已灭菌的镊子夹取上述步骤获得的无菌花药，接种在愈伤组织诱导培养基中，每瓶培养基接种16-20枚花药；

（4）愈伤组织诱导培养

将接种了花药的培养基放置于人工气候培养箱中培养55~60d，可获得黄绿色较疏松的愈伤组织；培养条件控制为温度24~26℃，相对湿度65~75％，连续黑暗。

所述步骤（1）中选择大部分花药小孢子处于单核靠边期的花蕾的方法为根据花蕾长度和花药颜色选择，花蕾选择长约33~35mm，花药选择浅绿色不透明即为所需花蕾。

所述步骤（3）中诱导培养基的配方为kno32200~2400mg/l，nh4no31030~1150mg/l，kh2po4220~260mg/l，mgso4·7h2o345~385mg/l，cacl2·2h2o410~460mg/l，mnso4·4h2o20~25mg/l，znso4·7h2o7~9mg/l，h3bo311~14mg/l，ki0.6~0.8mg/l，cuso4·5h2o0.022~0.026mg/l，cocl2·6h2o0.022~0.026mg/l，na2moo4·2h2o0.20~0.30mg/l，feso4·7h2o53~58mg/l，na2-edta60~64mg/l，肌醇62~70mg/l，谷胱甘肽34~40mg/l，赖氨酸4~7mg/l，丝氨酸12~15mg/l，维生素b10.3~0.6mg/l，维生素b60.4~0.7mg/l，泛酸0.45~0.55mg/l，复肽核酸0.33~0.37mg/l，硝酸铈2.5~3.0mg/l，聚乙烯醇0.8~1.2g/l，蔗糖15~20g/l，葡萄糖10~13g/l，植物凝胶2~4g/l，nan33.5~3.8mg/l，5-硝基愈创木酚钠0.4~0.6mg/l，芸苔素内酯0.01~0.02mg/l，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸2.4~3.0mg/l，马铃薯提取液30~36ml/l，酵母浸提液13~17ml/l，ph为5.6~6.0。

所述诱导培养基的最佳配方为kno32300mg/l，nh4no31090mg/l，kh2po4240mg/l，mgso4·7h2o365mg/l，cacl2·2h2o435mg/l，mnso4·4h2o23mg/l，znso4·7h2o8mg/l，h3bo312mg/l，ki0.7mg/l，cuso4·5h2o0.024mg/l，cocl2·6h2o0.024mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o54mg/l，na2-edta62mg/l，肌醇67mg/l，谷胱甘肽36mg/l，赖氨酸5mg/l，丝氨酸13mg/l，维生素b10.4mg/l，维生素b60.5mg/l，泛酸0.5mg/l，复肽核酸0.35mg/l，硝酸铈2.7mg/l，聚乙烯醇1.0g/l，蔗糖18g/l，葡萄糖12g/l，植物凝胶3g/l，nan33.6mg/l，5-硝基愈创木酚钠0.5mg/l，芸苔素内酯0.015mg/l，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸2.6mg/l，马铃薯提取液33ml/l，酵母浸提液15ml/l，ph为5.8。

本发明的有益效果在于：

1、本发明通过改善培养条件、调节培养基组分和添加诱变剂、高效植物激素等，能够更好地刺激植物生长，从而使美丽百合花药愈伤组织的诱导率达到35％以上；

2、本发明通过在培养基中添加聚乙烯醇、3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，显著提高了美丽百合花药愈伤组织的生长量，同时还降低了褐化率，从而保证了获得愈伤组织的质量；

3、本发明特别针对美丽百合花药的诱导培养特点进行深入的研究，摸索出了一种美丽百合花药愈伤组织的诱导方法，为美丽百合花药培养的产业化应用奠定技术基础。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明的有益效果作进一步说明，而非限制本发明。

试验材料：以下实施例中采用的美丽百合花药供体均来自江苏盛大花卉园艺基地。

实施例1

（1）新鲜花蕾的选取与预处理：

2016年6月上旬，此时为美丽百合现蕾期，选择花蕾长度为33~35mm，花药浅绿色不透明的美丽百合花蕾，此时大部分花药小孢子处于单核靠边期，将采集的花蕾用冰壶带回实验室，用湿润的纱布包裹后置于4℃冰箱中低温预处理3d；

（2）花蕾的表面消毒、无菌花药的获得；

美丽百合花蕾低温预处理后，将花蕾用自来水冲洗10~20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精浸泡5min，再用无菌水冲洗干净，然后用无菌滤纸吸干表面水分；于解剖镜下用镊子拨开花蕾取出花药投入0.5%邻苯二甲醛+2-3滴吐温-80消毒液中浸泡10min，再用无菌水冲洗3~4次后，即获得无菌花药；

（3）无菌花药的接种

在超净工作台无菌条件下，用已灭菌的镊子夹取上述步骤获得的无菌花药，接种在愈伤组织诱导培养基中，该诱导培养基的配方为kno32300mg/l，nh4no31090mg/l，kh2po4240mg/l，mgso4·7h2o365mg/l，cacl2·2h2o435mg/l，mnso4·4h2o23mg/l，znso4·7h2o8mg/l，h3bo312mg/l，ki0.7mg/l，cuso4·5h2o0.024mg/l，cocl2·6h2o0.024mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o54mg/l，na2-edta62mg/l，肌醇67mg/l，谷胱甘肽36mg/l，赖氨酸5mg/l，丝氨酸13mg/l，维生素b10.4mg/l，维生素b60.5mg/l，泛酸0.5mg/l，复肽核酸0.35mg/l，硝酸铈2.7mg/l，聚乙烯醇1.0g/l，蔗糖18g/l，葡萄糖12g/l，植物凝胶3g/l，nan33.6mg/l，5-硝基愈创木酚钠0.5mg/l，芸苔素内酯0.015mg/l，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸0.3mg/l，马铃薯提取液33ml/l，酵母浸提液15ml/l，每瓶培养基接种16-20枚花药；

（4）愈伤组织诱导培养

将接种了花药的培养基放置于人工气候培养箱中培养，培养条件控制为温度25℃，相对湿度70％，连续黑暗；培养58d后可获得黄绿色的愈伤组织，此时统计愈伤组织的诱导率和生长量。

实施例2

本实施例采用与实施例1相同的愈伤组织诱导方法，其中步骤（3）中使用的诱导培养基的配方为：ms改良培养基（vb1浓度提高到4.0mg/l），2,4-d0.5mg/l，kt4.0mg/l（该配方来自韩秀丽，田晓明，贾桂霞《新铁炮百合单倍体植株的诱导》），统计愈伤组织诱导率和生长量。

实施例3

本实施例采用与实施例1相同的愈伤组织诱导方法，其中步骤（3）中使用的诱导培养基的配方为：ms培养基，2,4-d4.0mg/l，6-ba2.0mg/l（该配方来自谷祝平，郑国锠《从百合花药诱导花粉植株的研究》），统计愈伤组织诱导率和生长量。

实施例4

本实施例采用与实施例1相同的愈伤组织诱导方法，其中步骤（3）中使用的诱导培养基的配方为：ms改良培养基（vb1浓度提高到4.0mg/l），2,4-d1.0mg/l，kt2.0mg/l（该配方来自褚云霞，陈龙清等《百合的花药培养研究》），统计愈伤组织诱导率和生长量。

实施例5

本实施例采用与实施例1相同的愈伤组织诱导方法，其中步骤（3）中使用的诱导培养基的配方为：ms改良培养基（蔗糖浓度降低到4g/l），naa0.4mg/l，6-ba0.5mg/l（该配方来自刘伟，常征等《淡黄花百合花药及子房不定芽诱导培养基筛选》），统计愈伤组织诱导率和生长量。

实施例6

本实施例采用与实施例1相同的愈伤组织诱导方法，其中步骤（3）中使用的诱导培养基的配方为：kno32600mg/l，nh4no31700mg/l，kh2po4460mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，cacl2·2h2o840mg/l，mnso4·4h2o22.5mg/l，znso4·7h2o8.5mg/l，h3bo36.25mg/l，ki0.825mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27.5mg/l，na2-edta37.5mg/l，肌醇100mg/l，维生素b10.1mg/l，维生素b60.5mg/l，烟酸0.5mg/l，甘氨酸2.0mg/l，丝氨酸0.8mg/l，2，4-d3.4mg/l，kt2.2mg/l，植物凝胶6.25g/l，椰乳15g/l，甘露醇22g/l，水解蛋白0.9g/l，活性炭0.4g/l，蔗糖60g/l（该配方来自中国专利cn105794653a《一种食用百合的花药培养脱毒方法》），统计愈伤组织诱导率和生长量。

将各个实施例愈伤组织诱导率及愈伤组织生长量结果统计如下表1。

从以上统计的结果可以看出，实施例1即本发明提供的诱导培养基对美丽百合花药愈伤组织的诱导率达到了37.2%，愈伤组织的生长量达到“＋＋＋”，均显著高于实施例2~6，实施例2~6均为前人设计的针对百合属其他百合品种的花药诱导培养基，由于百合不同品种之前存在基因型的差异，所适用的培养基也不同，说明本发明提供的培养基配方更适合于美丽百合花药培养，而且具有愈伤组织诱导率高、愈伤组织生长量大的优点，进而提高了花药培养效率，为美丽百合花培脱毒技术的应用奠定了坚实的基础。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。