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一种通过基因编辑ClSPL创制二倍体无籽西瓜的方法

花匠小妙招
2025-09-15 15:41

本发明涉及植物基因工程育种，更具体的说是涉及一种通过基因编辑clspl创制二倍体无籽西瓜的方法。

背景技术：

1、西瓜(citrullus lanatus)，其成熟果实中含有丰富的糖、有机酸、维生素和矿物质，具有重要的营养食用价值，是全世界普遍栽培、经济价值很高的重要园艺作物。无籽西瓜因其无籽食用方便、营养品质，丰产稳产和耐贮存受到消费者和生产者的青睐。传统的无籽西瓜研究主要集中于二倍体和四倍体西瓜杂交得到三倍体无籽、激素诱导和染色体易位等技术。研究报道经过强力坐瓜灵(cppu)处理未授粉的西瓜雌花，易产生无籽西瓜，但其成熟果实果型小、易诱发畸形和坐果率低严重影响其商品性(nunez et al.2008)。田树娟等(2021)研究发现突变体148材料的chr 06染色体上一段2.09mb片段发生易位可以诱导少籽西瓜。由于育种成本和周期条件限制，除三倍体无籽西瓜以外其他技术未在实际生产上得到广泛应用。传统的三倍体无籽西瓜通过四倍体和二倍体杂交而来，减数分裂过程联会紊乱，受精失败无种子产生，但在其育种过程中四倍体母本较难获得，三倍体种子种皮厚、发芽率低和成苗率低导致种子生产成本较高。生产过程中育种周期长和成本高极大地限制了三倍体无籽西瓜的推广与发展。近年来，无籽西瓜在分子生物学水平上的技术研究处于起步阶段，随着基因工程在育种领域的应用，可对调控生殖发育的基因进行crispr/cas9编辑，使在二倍体水平上创制无籽西瓜成为可能。

2、高等植物的生活史是一个二倍体孢子世代与单倍体配子世代交替发生的过程，受复杂的遗传调控网络精准调控。从孢子体到配子体的转变需要通过减数分裂形成单倍体细胞，这一过程为孢子发生(yuan and sundaresan,2014)。spl/nzz是目前已知的最早调控孢子阶段形成的关键基因，编码一个mads box转录因子相关的核蛋白，对生殖细胞命运的决定极为重要(schiefthaler et al.1999；yang et al.1999)。但是，目前spl在改良西瓜无籽果实性状方面还未曾报道。

3、crispr/cas9介导的植物基因组编辑技术可以对西瓜的无籽性状进行定点改造，进而实现无籽西瓜的精准育种。因此，提供一种通过基因编辑clspl创制二倍体无籽西瓜的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种通过基因编辑clspl创制二倍体无籽西瓜的方法，利用crispr/cas9对西瓜mads box转录因子clspl(cla97c11g224710)进行基因编辑创制二倍体无籽西瓜，缩短育种周期，减少育种成本。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种双靶位敲除载体，包括grna1和grna2，或grna3和grna4双靶点；

4、所述grna1、grna2、grna3、grna4序列如下：

5、grna1：5’-tggcgactccaatccacac-3’；seq id no.3；

6、grna2：5’-cgcccagctcgaacgattg-3’；seq id no.4；

7、grna3：5’-aaccgccgcagagaggcct-3’；seq id no.5；

8、grna4：5’-cctgccgccgcaccgccaa-3’；seq id no.6。

9、进一步，一种通过基因编辑clspl创制二倍体无籽西瓜的方法，具体步骤如下：

10、1)根据clspl cds序列设所述的靶点grna1、grna2、grna3、grna4；

11、2)构建clspl crispr/cas9双靶位敲除载体；grna1和grna2，grna3和grna4分别组合双靶点；

12、(1)利用限制性内切酶bsai-hf对crispr/cas9载体pbse402进行酶切，回收酶切后的载体pbse402；

13、(2)以中间载体pcbc-dt1t2为模板，利用引物target1-1f/target1-2r和target1-3f/target1-4r分别进行pcr扩增，分别回收目的片段1和目的片段2；

14、(3)将步骤(1)酶切后的载体pbse402与步骤(2)回收的目的片段分别进行同源重组，转化dh5α感受态；

15、(4)将步骤(3)得到的菌落分别摇菌并抽提重组质粒，测序比对，将测序正确的重组质粒分别转化至农杆菌eha105感受态中；

16、(5)将步骤(4)得到的菌落进行pcr检测，验证正确后进行西瓜遗传转化；

17、3)西瓜遗传转化经过侵染、共培养、恢复培养、选择培养、芽伸长培养和生根培养阶段得到转基因植株；

18、4)将步骤3)获得的转基因植株进行基因编辑检测，将基因编辑植株移栽至试验田进行无籽表型观察。

19、西瓜遗传转化选用的材料为野生品种‘yl’和栽培红瓤品种(red flesh rf)‘jm’。

20、进一步，所述clspl cds序列如seq id no.2所示。

21、进一步，所述引物target1-1f/target1-2r和target1-3f/target1-4r序列如下：

22、target1-1f：

23、5’-tcgaagtagtgattgtggcgactccaatccacacgttttagagctagaaatagc-3’；seq idno.7；

24、target1-2r：

25、5’-ttctagctctaaaaccaatcgttcgagctgggcgcaatctcttagtcgactcta-3’；seq idno.8；

26、target1-3f：

27、5’-tcgaagtagtgattgaaccgccgcagagaggcctgttttagagctagaaatagc-3’；seq idno.9；

28、target1-4r：

29、5’-ttctagctctaaaacttggcggtgcggcggcaggacaatctcttagtcgactcta-3’；seq idno.10。

30、进一步，所述的双靶位敲除载体或所述的方法在无籽西瓜育种中的应用。所述基因编辑是借助crispr/cas9系统来实现的。clspl突变体营养生长不受影响，雌雄配子不育，野生型花粉对其授粉不能正常受精，西瓜果实表现为完全无籽。

31、对栽培种红壤‘jm’clsplrf/clsplrf杂合编辑植株f1代设计indel分子标记，苗期筛选出clsplrf/clsplrf纯合编辑植株，无籽表型可以无限繁殖，加速二倍体无籽西瓜的创制进程。提取待测西瓜植株的dna，设计引物进行pcr扩增，对pcr产物通过3％琼脂糖凝胶电泳以显示结果。

32、本发明基因编辑方法可以缩短无籽西瓜育种周期，节约育种成本，丰富育种资源，加速无籽西瓜的良种繁育。

33、本发明采用crispr/cas9技术，对西瓜clspl基因靶向敲除，从而使得基因功能缺失，雌雄配子不育，创制二倍体无籽西瓜。并对栽培种红瓤材料‘jm’clsplrf/clsplrf杂合编辑植株f1代设计indel分子标记，苗期筛选出clsplrf/clsplrf纯合编辑植株，加速二倍体无籽西瓜的创制进程。本发明通过crispr/cas9创制的二倍体无籽西瓜，有效缩短无籽西瓜的育种周期，为无籽西瓜在分子生物学水平上的研究提供了理论基础。

34、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了通过基因编辑clspl创制二倍体无籽西瓜的方法，首次利用crispr/cas9技术，对西瓜clspl基因进行靶向编辑，使其基因功能缺失，雌雄配子不育，野生型花粉对其授粉不能正常双受精，种子败育，从而创制二倍体无籽西瓜。并对栽培种红瓤材料‘jm’clsplrf/clsplrf杂合编辑植株f1代设计indel分子标记，苗期筛选出clsplrf/clsplrf纯合编辑植株，无籽表型可以通过杂合编辑植株繁殖下去，加速二倍体无籽西瓜的创制进程。通过本方法创制的二倍体无籽西瓜编辑植株与野生型材料相比，除了雌雄配子不育，营养生长阶段无明显表型变化。该方法具有简单易行、效率高、成本低和周期短等优点。通过基因编辑clspl创制二倍体无籽西瓜，缩短育种周期，节约育种成本，丰富无籽西瓜育种资源，加速无籽西瓜的良种繁育进程。