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新补骨脂异黄酮及其组合物和它们作为杀虫剂的用途的制作方法

花匠小妙招
2025-09-17 14:15

1.本发明总体上涉及一种用于农业用途的具有杀真菌性质和杀菌性质的植物次级代谢产物。

背景技术：

2.植物病虫害是现代农业生产力的主要挑战。
3.锈菌是多样化的植物病原体组，具有数十属和数千种。它们具有巨大的经济重要性，并且可能导致谷物、玉米和大豆产量损失几十个百分点(gessese 2019年,groth等人,1998年；hershman等人,2011年)。
4.柄锈菌属，是一种强制性的致病真菌，并且也是属于担子菌系统发育谱系的植物锈菌的主要属。柄锈菌属，在谷物(诸如小麦中的黄锈病)和玉米(普通锈病)中引起广泛的商业上显著的植物病害(gessese 2019年；groth等人,1998年)。
5.土壤传播的植物病原体对农作物造成了严重的损害。植物病原真菌丝核菌属，属于担子菌系统发育谱系，并且引起广泛的商业上显著的植物病害，诸如褐斑病、幼苗立枯病、根腐病和腹腐病。植物中的所有丝核菌病以及随后的二次感染都很难控制(erlacher等人,2014年)。充分的控制丝核菌属对诸如水稻等各种农作物和各种蔬菜的生产力至关重要。
6.腐霉菌属，是一种植物病原真菌样类生物，其属于被称为卵菌纲的真核微生物的系统发育谱系，导致各种蔬菜广泛的“立枯”疾病(nzungize等人,2012年)。
7.疫霉菌属，是一种强制性的植物真菌样病原体，其属于被称为卵菌纲的真核微生物的系统发育谱系。致病疫霉是一种严重的马铃薯疾病，称为马铃薯枯萎病，导致叶枯病和块茎腐烂。该疾病可导致马铃薯收成完全丧失(sedl
á
kov
á
等人,2012年)。疫霉菌侵袭多种植物种类的地上部分，并且是引起番茄、南瓜等作物枯病、溃疡病和果实腐烂病的主要原因。
8.核盘菌属，是一种植物病原真菌，属于子囊菌的系统发育谱系。核盘菌属，在许多植物寄主中引起一种叫做白绢病的疾病，这些寄主的大多数是蔬菜(mizubuti,e.s.g 2019年)。
9.假单胞菌属，是一种植物病原细菌属，在各种不同的作物中具有毒性，并引起显著的叶损伤和茎损伤。假单胞菌属，在经济上显著的作物和果园中引起以下疾病：欧洲防风草和番茄的髓坏死、水稻的褐斑病和叶鞘褐腐病、杏仁的细菌溃疡病和橄榄的橄榄结病(moore l.w.,1988年；hofte m.和de vos p.,2006年)。已经测试了多种方法来管理农作物中的假单胞菌属。它们包括培育管理、寄主抗性、微生物拮抗剂的生物控制和化学控制。它们都没有完全的控制权。
10.由于日益增长的抗虫性、不稳定的气候条件和不断增加的监管压力，可用于作物保护目的以对抗这些疾病的有效成分的数量逐年减少。开发新的环境可持续作物保护解决方案迫切需要新的活性成分。

技术实现要素：

11.在一方面，本发明涉及一种用于在植物、植物器官、植物部分或植物繁殖材料上控制、防止、减少或根除的植物病原体感染或它们的实例的方法，该方法包括：向植物、植物部分、植物器官或植物繁殖材料，或向所述植物周围的土壤施用杀虫有效量的新补骨脂异黄酮或其农业上可接受的盐，或包括杀虫有效量的新补骨脂异黄酮或其农业上可接受的盐的农药组合物，其中所述植物病原体是选自以下的成员：一类担子菌，选自柄锈菌纲和伞菌纲；腐霉科的卵菌；假单胞菌目的细菌；和核盘菌科的子囊菌。
12.在另一方面，本发明提供了一种包括新补骨脂异黄酮或其农业上可接受的盐作为活性农药成分的农药组合物。
附图说明
13.图1至图5示出了新补骨脂异黄酮(nbi)在五个独立的实验中，对玉米叶被玉米柄锈菌感染的影响，测定为被真菌覆盖的叶百分比。其中，*-p-值＜0.05,**-p-值为＜0.01，***-p-值为＜0.001；希格诺为一种含有26.7％w/w啶酰菌胺和6.7％w/w吡唑醚菌酯的参考杀菌剂f1，调配物1；f2，调配物2
–
参见实例5；ppm
–
百万分率。
14.图6示出了在室温条件下，新补骨脂异黄酮(nbi)在三个独立的实验中，对小麦叶被小麦叶锈菌感染的影响，测定为被真菌覆盖的叶百分比。呈现了3个独立实验的平均值。调配物1参见下文“用于活体转化法验证的调配物制备”。
15.图7示出了在受控的温度和光条件下，新补骨脂异黄酮(nbi)在生长室中，对小麦叶被小麦叶锈菌感染的影响，测定为被真菌覆盖的叶百分比。呈现了3个独立的复制的平均值。其中，**意指p值＜0.01；调配物1参见下文“用于活体转化法验证的调配物制备”。
16.图8至图9示出了nbi在治疗方法中防止和控制来自两个不同品种的小麦植株中的小麦条锈病(黄锈病)的有效性(图8-实例102，图9-实例108)。调配物3和调配物4参见下文“用于活体转化法验证的调配物制备”。
具体实施方式
17.本发明基于从含有大量植物次生代谢物的文库中筛选得到的发现。发现新补骨脂异黄酮是若干担子菌真菌、腐霉科卵菌、假单胞菌目细菌和核盘菌科子囊菌的有效杀虫剂。
18.新补骨脂异黄酮是7-羟基异黄酮类的成员，是7-羟基异黄酮，在4’位处具有额外的羟基，并且在3’位处具有异戊二烯基。在主要来自豆科的植物中发现了新补骨脂异黄酮(bronikowska等人,2010年)。
19.因此，在一方面，本发明提供了一种用于在植物、植物器官、植物部分或植物繁殖材料上控制、防止、减少或根除的植物病原体感染或它们的实例的方法，该方法包括：向植物、植物部分、植物器官或植物繁殖材料，或向所述植物周围的土壤施用杀虫有效量的新补骨脂异黄酮或农药组合物，或包括杀虫新补骨脂异黄酮的调配物，其中所述植物病原体是选自以下的成员：一类担子菌，选自柄锈菌纲和伞菌纲；腐霉科的卵菌；假单胞菌目的细菌；和核盘菌科的子囊菌。
20.在某些实施例中，植物病原体是引起锈病的担子菌的成员。
21.本发明的处理方法用于例如对抗农业中的以下常见锈菌：
22.五叶松锈病(白松疱锈病)；主要寄主是醋栗，并且其次是美国五针松。主要是杂环和大环。
23.美洲苹果锈病菌(桧胶锈病)；北美圆柏是主要(冬孢子堆的)寄主，以及苹果、梨或山楂是次要(锈孢子器的)寄主。转主寄生的和缺夏孢型的。
24.咖啡锈菌(咖啡叶锈病)；主要寄主是咖啡树；未知的替代寄主。转主寄生的。
25.山马蝗层锈菌和大豆诱菌(大豆锈病)；主要寄主是大豆和各种豆类。未知的替代寄主。转主寄生的。
26.禾冠柄锈菌(燕麦和黑麦草冠锈病)；燕麦是主要寄主；鼠李属(沙棘)是替代寄主。转主寄生的和大环。
27.禾柄锈菌(小麦和草地早熟禾的茎锈病，或谷物的黑锈病)；主要寄主包括：草地早熟禾、大麦和小麦；常见的伏牛花是替代寄主。转主寄生的和大环。
28.黄花菜柄锈菌(黄花菜锈病)；黄花菜是主要寄主；苍耳属是替代寄主。转主寄生的和大环。
29.持久柄锈菌亚种，小麦叶锈菌导致谷物中的小麦锈病。它也被称为“褐色或红色锈”。
30.玉米锈病菌在玉米中引起常见锈病。
31.小麦条锈病在谷物中引起“黄锈”。
32.黑头柄锈菌在甘蔗中引起“褐锈病”。
33.屈恩柄锈菌在甘蔗中引起“橙锈病”。
34.菜豆锈病菌引起普通豆类(菜豆)的菜豆锈病
35.菜豆单胞锈菌；主要寄主：大豆。单主寄生的和大环的。
36.在某些实施例中，植物病原体是包含5个目的柄锈菌纲的成员：螺旋菌属、卷叶菌属、扁形菌属、柄菌属和七叶菌属。
37.在某些实施例中，柄锈菌植物病原体是柄锈菌目的成员，其包含以下科：共基锈菌科、茶藨子科、鞘锈菌科、柱锈菌科、栅锈菌科、细黑锈菌科、层锈菌科、多胞锈菌科、扁孢锈菌科、柄锈菌科、陷柄锈菌科、膨痂锈菌科、伞锈菌科、球锈菌科、钩锈菌科、肥柄锈菌科、丝裂孢子菌、和柄锈菌科。
38.在某些实施例中，柄锈菌属植物病原体是柄锈菌科的成员。
39.在某些实施例中，柄锈菌科植物病原体是柄锈菌属的成员，例如，玉米锈病菌、小麦柄锈菌、小麦条锈病(黄锈病)、冠锈菌、禾柄锈菌、萱草柄锈菌、持久柄锈菌亚种、小麦叶锈菌和屈恩柄锈菌。
40.在某些实施例中，柄锈菌属植物病原体是层锈菌科的成员。
41.在某些实施例中，层锈菌科植物病原体是层锈菌属的成员，例如，亚洲锈病、aeciure、arthuria、batistopsora、bubakia、catenulopsora、蜡锈属、crossopsora、dasturella、桂林锈菌属、macabuna、monosporidium、newinia、nothoravenelia、层锈菌属、phragmidiella、physopella、pucciniostele、scalarispora、tunicopsora、uredendo、uredopeltis、以及uredostilbe。
42.在某些实施例中，柄锈菌属植物病原体是地位未定的柄锈菌科的成员。
43.在某些实施例中，地位未定的柄锈菌科植物病原体柄锈菌是驼孢锈菌属的成员，
例如咖啡锈菌。
44.在某些实施例中，植物病原体是包含若干目和亚纲的伞菌纲的成员：伞菌亚纲科、伞菌目科、淀粉皮质类、手足徐动菌科、牛肝菌科、瘿蚊科、鳞翅目、真菌科、瘿蚊科、子宫菌科、真菌科、真菌科、鸡油菌科、皮质类、球孢菌科、膜壳菌科、多孔菌科、赤眼蜂科、皮脂腺科、立体菌科、革菌目、三孢菌属。
45.在某些实施例中，植物病原体是鸡油菌目的成员。
46.在某些实施例中，鸡油菌目植物-病原体是角担菌科的成员，其包含角担菌属d.p.rogers,角菌根菌属r.t.moore(无性型),rhizoctonia dc.(无性型),scotomyces j
ü
lich和scotomyces j
ü
lich。
47.在某些实施例中，角担菌科植物病原体是诸如立枯丝核菌等丝核菌属的成员。
48.在某些实施例中，植物-病原体是腐霉科的一员，包括囊霉属、散生霉属、球孢霉属、壶菌属、胞霉属、疫霉属、腐霉属和管胞霉属。
49.在某些实施例中，上述实施例中的任何实施例的方法对疫霉属，特别是对致病疫霉无效。
50.在某些实施例中，腐霉科植物病原体是诸如瓜果腐霉等腐霉菌属的成员。
51.在某些实施例中，植物病原体是假单胞菌目的成员，其包括若干科：莫拉氏菌科、假单胞菌科和风单胞菌科。
52.在某些实施例中，假单胞菌目植物病原体是假单胞菌科的成员，其包括固氮菌属、氮单胞菌属、嗜氮根瘤菌属、固氮菌、中嗜杆菌属、气管菌属、双歧杆菌、假单胞菌、皱纹单胞菌属和硫假单胞菌。
53.在某些实施例中，假单胞菌科植物病原体是诸如丁香假单胞菌等假单胞菌属的成员。
54.在某些实施例中，植物病原体是核盘菌科的成员，其包括以下属：紫菀属、盘菌属、葡萄孢属、杯盘菌属、叶杯菌属、coprotinia、cudoniopsis、dicephalospora、dumontinia、elliottinia、绿散胞盘菌、grovesinia、kohninia、lambertellina、martininia、地杖菌属、mitrulinia、链核盘菌属、moserella(位置不确定)、myriosclerotinia、卵孢核盘菌属、苹果念珠病菌、poculina、pseudociboria、pycnopeziza、redheadia、sclerocrana、核盘菌属、seaverinia、septotinia、streptotinia、座盘菌属、torrendiella、valdensinia和zoellneria。
55.在某些实施例中，核盘菌科植物病原体是诸如核盘菌等核盘菌属的成员。
56.在某些实施例中，上述实施例中的任何实施例的方法针对葡萄孢菌属，特别是针对葡萄孢菌属无效。
57.在本发明方法的实施例中任何实施例中使用的农药组合物可以配制成便于施用活性农药成分的调配物。
58.因此，在另外的方面，本发明涉及一种包括新补骨脂异黄酮或其农业上可接受的盐作为活性农药成分的农药组合物或调配物。
59.在某些实施例中，组合物或调配物包括杀虫有效量的新补骨脂异黄酮。
60.在某些实施例中，上述实施例中的任何实施例的农药组合物或调配物还包括农业上合适或可接受的溶剂或增溶剂。
61.在某些实施例中，农业上可接受的溶剂或增溶剂是能够溶解或增溶新补骨脂异黄酮的水混溶性溶剂。
62.在某些实施例中，能够溶解或增溶新补骨脂异黄酮的水混溶性溶剂是极性溶剂，诸如醇、酮、内酯、酮醇、二醇、缩水甘油醚、酰胺、链烷醇胺、亚砜和吡咯烷酮。
63.在特定实施例中，上述实施例中的任何实施例的组合物包括选自二甲基亚砜或乙醇的溶剂。
64.本发明的组合物可以是水混溶性制剂，诸如悬浮剂(sc)、胶囊悬浮剂(cs)、水分散粒剂(wg)、可乳化浓缩物(可乳化浓缩物)、可湿性粉剂(wp)、可溶性(液体)浓缩物(sl)和可溶性粉剂(sp)。
65.该组合物可以进一步包括至少一种溶剂或增溶剂、触变剂、助剂、载剂、稀释剂和/或表面活性剂。
66.佐剂的非限制性实例是活化剂佐剂，诸如多糖；阳离子、阴离子或非离子表面活性剂；能够提高农药产品活性的油和氮基肥料。
67.在本实施例的组合物中也用作触变剂的多糖佐剂的非限制性实例是黄原胶(由cp kelco以商标购得)，其由单糖使用发酵工艺生产，并且其名称来源于所用的细菌种类，野油菜黄单胞菌。用作辅助剂的油可以是植物油，诸如石蜡或萘基石油、基于可乳化石油基油的植物油浓缩物，以及衍生自种子油的植物油浓缩物，通常是棉花、亚麻子、大豆或向日葵油，用于控制杂草。氮基肥料可以是硫酸铵或尿素-硝酸铵。
68.增溶剂或溶剂的非限制性实例是石油基溶剂、上述油、脂肪酸的液体混合物、乙醇、甘油和二甲基亚砜。农业上可接受的溶剂或增溶剂可以是能够溶解或增溶新补骨脂异黄酮的水混溶性溶剂，诸如极性溶剂，例如，醇、酮、内酯、酮醇、二醇、缩水甘油醚、酰胺、链烷醇胺、亚砜和吡咯烷酮。
69.载剂的非限制性实例是沉淀二氧化硅、胶态二氧化硅、凹凸棒石、瓷土、滑石、高岭土及它们的组合。
70.上述实施例中的任何实施例的农药调配物可进一步包括稀释剂，诸如乳糖、淀粉、尿素、水溶性无机盐及它们的组合。
71.上述实施例中的任何实施例的农药组合物可进一步包括一种或多种表面活性剂，例如，聚山梨酯型非离子表面活性剂，诸如聚山梨酯20(西格玛公司(sigma)以商标tween-购得)、三硅氧烷非离子表面活性剂、苯乙烯丙烯酸类分散剂聚合物、酸性树脂共聚物基分散剂、聚羧酸钾、烷基萘磺酸钠混合物、二异丙基萘磺酸钠、萘磺酸钠缩合物的钠盐、木质素磺酸盐及它们的组合。三硅氧烷非离子表面活性剂或聚醚二甲基硅氧烷(pems)，通常被称为超分散剂或超湿润剂，被添加至农药中，通过促进活性物质在叶片疏水表面上的快速扩散来增强活性物质的活性和防雨性。l-77撒布机是一种改性的三硅氧烷，它将极低分子量的三硅氧烷与聚醚基团结合在一起，并且能够降低表面张力，并在难以湿润的表面快速撒布。
72.活性试剂、组合物或包括它的调配物以上述实施例中的任何实施例的方法通过喷雾、浸泡、敷料、包衣、制粒或浸泡施加至植物或其部分、器官或植物繁殖材料上。
73.定义
74.本文所使用的术语“植物器官”是指叶结构、茎结构、根结构和生殖结构。
75.本文所使用的术语“植物部分”是指植物材料，诸如插条或块茎；叶子、花、花、花序、树皮或茎。
76.本文所使用的术语“植物繁殖材料”是指种子、根、果实、块茎、球茎、根茎或植物的一部分。
77.本文所使用的术语“农药有效量”是指能够导致至少一种害虫死亡，或显著减少害虫生长、取食或正常生理发育的农药量。
78.在某些实施例中，在上述实施例中的任何实施例中的新补骨脂异黄酮的杀虫有效量高达约2000ppm，或介于50ppm-2000ppm、100ppm-2000ppm、150ppm-2000ppm、200ppm-2000ppm、250ppm-2000ppm、300ppm-2000ppm、350ppm-2000ppm、400ppm-2000ppm、450ppm-2000ppm、500ppm-2000ppm、550ppm-2000ppm、600ppm-2000ppm、650ppm-2000ppm、700ppm-2000ppm、750ppm-2000ppm、800ppm-2000ppm、850ppm-2000ppm、900ppm-2000ppm、950ppm-2000ppm、1000ppm-2000ppm、1500ppm-2000ppm、50ppm-1500ppm、100ppm-1500ppm、150ppm-1500ppm、200ppm-1500ppm、250ppm-1500ppm、300ppm-1500ppm、350ppm-1500ppm、400ppm-1500ppm、450ppm-1500ppm、500ppm-1500ppm、550ppm-1500ppm、600ppm-1500ppm、650ppm-1500ppm、700ppm-1500ppm、750ppm-1500ppm、800ppm-1500ppm、850ppm-1500ppm、900ppm-1500ppm、950ppm-1500ppm、1000ppm-1500ppm、50ppm-1000ppm、100ppm-1000ppm、150ppm-1000ppm、200ppm-1000ppm、250ppm-1000ppm、300ppm-1000ppm、350ppm-1000ppm、400ppm-1000ppm、450ppm-1000ppm、500ppm-1000ppm、550ppm-1000ppm、600ppm-1000ppm、650ppm-1000ppm、700ppm-1000ppm、750ppm-1000ppm、800ppm-1000ppm、850ppm-1000ppm、900ppm-1000ppm、950ppm-1000ppm、50ppm-950ppm、100ppm-950ppm、150ppm-950ppm、200ppm-950ppm、250ppm-950ppm、300ppm-950ppm、350ppm-950ppm、400ppm-950ppm、450ppm-950ppm、500ppm-950ppm、550ppm-950ppm、600ppm-950ppm、650ppm-950ppm、700ppm-950ppm、750ppm-950ppm、800ppm-950ppm、850ppm-950ppm、900ppm-950ppm、50ppm-900ppm、100ppm-900ppm、150ppm-900ppm、200ppm-900ppm、250ppm-900ppm、300ppm-900ppm、350ppm-900ppm、400ppm-900ppm、450ppm-900ppm、500ppm-900ppm、550ppm-900ppm、600ppm-900ppm、650ppm-900ppm、700ppm-900ppm、750ppm-900ppm、800ppm-900ppm、850ppm-900ppm、50ppm-850ppm、100ppm-850ppm、150ppm-850ppm、200ppm-850ppm、250ppm-850ppm、300ppm-850ppm、350ppm-850ppm、400ppm-850ppm、450ppm-850ppm、500ppm-850ppm、550ppm-850ppm、600ppm-850ppm、650ppm-850ppm、700ppm-850ppm、750ppm-850ppm、800ppm-850ppm、50ppm-800ppm、100ppm-800ppm、150ppm-800ppm、200ppm-800ppm、250ppm-800ppm、300ppm-800ppm、350ppm-800ppm、400ppm-800ppm、450ppm-800ppm、500ppm-800ppm、550ppm-800ppm、600ppm-800ppm、650ppm-800ppm、700ppm-800ppm、750ppm-800ppm、50ppm-750ppm、100ppm-750ppm、150ppm-750ppm、200ppm-750ppm、250ppm-750ppm、300ppm-750ppm、350ppm-750ppm、400ppm-750ppm、450ppm-750ppm、500ppm-750ppm、550ppm-750ppm、600ppm-750ppm、650ppm-750ppm、700ppm-750ppm、50ppm-700ppm、100ppm-700ppm、150ppm-700ppm、200ppm-700ppm、250ppm-700ppm、300ppm-700ppm、350ppm-700ppm、400ppm-700ppm、450ppm-700ppm、500ppm-700ppm、550ppm-700ppm、600ppm-700ppm、650ppm-700ppm、50ppm-650ppm、100ppm-650ppm、150ppm-650ppm、200ppm-650ppm、250ppm-650ppm、300ppm-650ppm、350ppm-650ppm、400ppm-650ppm、450ppm-650ppm、500ppm-650ppm、550ppm-650ppm、600ppm-650ppm、50ppm-600ppm、100ppm-600ppm、150ppm-600ppm、
200ppm-600ppm、250ppm-600ppm、300ppm-600ppm、350ppm-600ppm、400ppm-600ppm、450ppm-600ppm、500ppm-600ppm、50ppm-550ppm、100ppm-550ppm、150ppm-550ppm、200ppm-550ppm、250ppm-550ppm、300ppm-550ppm、350ppm-550ppm、400ppm-550ppm、450ppm-550ppm、500ppm-550ppm、50ppm-500ppm、100ppm-500ppm、150ppm-500ppm、200ppm-500ppm、250ppm-500ppm、300ppm-500ppm、350ppm-500ppm、400ppm-500ppm、450ppm-500ppm、50ppm-450ppm、100ppm-450ppm、150ppm-450ppm、200ppm-450ppm、250ppm-450ppm、300ppm-450ppm、350ppm-450ppm、400ppm-450ppm、50ppm-400ppm、100ppm-400ppm、150ppm-400ppm、200ppm-400ppm、250ppm-400ppm、300ppm-400ppm、350ppm-400ppm、50ppm-350ppm、100ppm-350ppm、150ppm-350ppm、200ppm-350ppm、250ppm-350ppm、300ppm-350ppm、50ppm-300ppm、100ppm-300ppm、150ppm-300ppm、200ppm-300ppm、250ppm-300ppm、50ppm-250ppm、100ppm-250ppm、150ppm-250ppm、200ppm-250ppm、50ppm-200ppm、100ppm-200ppm、150ppm-200ppm、50ppm-150ppm、或100ppm-150ppm之间。类似地，在上述实施例中的任何实施例中的新补骨脂异黄酮的杀虫有效量为约10ppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、100ppm、150ppm、200ppm、250ppm、300ppm、350ppm、400ppm、450ppm、500ppm、550ppm、600ppm、650ppm700ppm、750ppm、800ppm、850ppm、900ppm、950ppm、1000ppm、1050ppm、1100ppm、1150ppm、1200ppm、1250ppm、1300ppm、1350ppm、1400ppm、1450ppm、1500ppm、1550ppm、1600ppm、1650ppm、1700ppm、1750ppm、1800ppm、1850ppm、1900ppm、1950ppm、或2000ppm。
79.如本文所使用的术语“农业上可接受的盐”指但不限于诸如钠盐和钾盐等碱金属盐；诸如钙盐和镁盐等碱土金属盐；诸如未取代的铵盐和单取代或多取代的铵盐等铵盐，以及与其它有机氮碱的盐。通常，当以盐的形式存在时，新补骨脂异黄酮包括新补骨脂异黄酮的钠盐。
80.术语“纲”、“目”、“科”、“属”和“种”在此根据藻类、真菌和植物的国际命名规则第3.1条使用。
81.除非另有说明，本说明书中使用的所有数字应理解为在所有情况下都被术语“大约”修饰。因此，除非指明是相反的，否则本说明书中给出的数值参数是近似值，根据本发明获得的所需性能，其变化可达正负10％。
82.现在将通过以下非限制性实例来说明本发明。
83.实例
84.缩写列表：
85.2：pdbc-pdbc用无菌蒸馏水稀释2倍
86.cfu-菌落形成单位
87.dmso-二甲亚砜
88.lb-lb培养液
89.lba-lb琼脂
90.pda-马铃薯葡萄糖琼脂
91.pdac-马铃薯葡萄糖琼脂20ug/ml氯霉素
92.pdbt-具有12ug/ml四环素的马铃薯葡萄糖培养液
93.rcf-相对离心力
94.rpm-每分钟转动次数
95.sch-斯密特纳介质
96.实例1：基于微孔板的新补骨脂异黄酮对玉米锈病菌生物活性测定。
97.背景：柄锈菌是属于担子菌的一种真菌，并且是一种空气传播的病原体。在生长室中，在玉米植株上生长柄锈菌孢子，并且针对每个实验从感染的玉米叶片制备新鲜孢子悬浮液。由于柄锈菌是一种强制性的病原体，并且不能在合成培养基上生长，因此仅监测孢子的萌发作为化合物生物活性的指标。
98.概述：将稀释的纯化后的新补骨脂异黄酮添加至微孔板孔中，并与新制备的孢子悬浮液混合，并且在显微镜下通过目视检查监测孢子的萌发。
99.试剂：材料吐温20(tidea有限公司)非离子洗涤剂，dmso-二甲基亚砜贝克-波兰)溶剂。
100.设备：离心机、振荡器、培养箱、显微镜。
101.方法
102.柄锈菌孢子制剂
103.接种用玉米幼苗的制备：
104.1)使用120x 80x 80mm的盆；
105.2)使用标准花园土壤和肥料；
106.3)使用敏感品种的玉米种子；
107.4)把盆放在小托盘里；
108.5)用泥土填充盆，直到顶部；
109.6)为种子做一个小圆槽；
110.7)在每个盆中种植大约10粒玉米种子；
111.8)用另外的土壤覆盖种子；
112.9)在托盘中添加水-每个盆约100ml；土壤应湿润，并且24小时后托盘中不应有水；
113.10)玉米在22℃的生长室中生长7天(直至第二片叶子出现)。
114.从玉米叶制备孢子悬浮液用于接种和发芽研究：
115.1)将20片带有孢子的玉米叶插入50ml无菌管中；
116.2)添加50ml冰箱冷藏的0.05％吐温20溶液；
117.3)将管插入密封的、冰冷却的塑料盒中；
118.4)用振动器以300rpm的速度振荡盒子15min；
119.5)将悬浮液(不带叶)转移至干净的无菌50ml管中；
120.6)将带有孢子悬浮液的试管放在冰上。
121.接种制备：
122.1)用冷的0.05％吐温20溶液稀释孢子悬浮液至300ml；
123.2)检查悬浮液中的孢子浓度，浓度应为约600个孢子/毫升，并且悬浮液应为浅棕色；
124.3)将孢子悬浮液置于冰上。
125.发芽评估：
126.1)用5微米滤膜制备过滤系统，并用无菌冷水冲洗滤膜；
127.2)将50ml管中的孢子悬浮液缓慢悬浮并倾析至膜中心的过滤系统中，孢子应该积
聚在膜上；
128.3)冲洗孢子以丢弃细菌和其它真菌孢子，停止真空并喷洒冷无菌水以悬浮和冲洗孢子，再恢复真空；
129.4)再重复孢子清洗2次以上；
130.5)将带有孢子的膜插入装有30ml 0.05％吐温20的无菌冷管中，并用手振荡管；
131.6)移除薄膜并将该薄膜丢弃；
132.7)将过滤后的液体倾析至水槽中，并用自来水清洗过滤系统并将该过滤系统干燥；
133.8)添加30ul氯霉素储备溶液(20mg/ml)，直至最终浓度达到20ug/ml；
134.9)将孢子悬浮液通过8层纱布过滤到50ml的管中；
135.10)检查悬浮液中的孢子浓度-浓度应约为7.5x 103孢子/毫升，且应为棕色；30ml孢子悬浮液足以筛选20个微孔板；
136.11)将孢子悬浮液置于冰上。
137.幼苗感染：
138.1)将孢子悬浮液转移至250ml烧杯中；
139.2)缓慢旋转20mm搅拌器(500rpm)，以保持孢子悬浮，并在烧杯周围添加冰；
140.3)将盆中所有幼苗的叶子深置于孢子悬浮液中10分钟；
141.4)将具有接种苗的盆置于温度为22℃、湿度为99％的潮湿腔室24小时(将水加热至32℃)；
142.5)24小时后，将盆转移至生长室，并用塑料袋覆盖幼苗；
143.6)在22℃的生长室中生长玉米；
144.7)接种后7天，叶片上应出现褐色斑点；
145.8)接种11天后，移除塑料袋以防止真菌污染，并使用橡皮筋将幼苗固定在一起；
146.9)接种12天后，可以收集带有孢子的叶子以用于制备孢子悬浮液。
147.用于筛选已发芽的柄锈菌孢子的微孔板制备：
148.1)从-20℃的冰箱中取出带有新补骨脂异黄酮的板，并且在台面上解冻至少20分钟；
149.2)从-20℃冰箱中取出带有材料的控制盘，并且在台面上解冻至少20分钟；
150.3)所有微孔板应包含10ul新补骨脂异黄酮；
151.4)向所有微孔板的所有孔中添加15ul柄锈菌孢子悬浮液在将孢子悬浮液转移至孔中之前，通过移液管(上下)悬浮孢子；
152.5)用透明密封剂密封所有板；
153.6)将所有测试板在1000rcf下离心1秒，并停止收集板底部的液体；
154.7)以1000rpm的速度振荡所有板10秒，并检查孔中的孢子分散情况；
155.8)将所有的板插入至塑料盒中，并将盒子放入25℃的培养箱中过夜。
156.板的筛选：
157.1)在悬浮液制备后12小时-24小时，使用放大倍数为10x 10的显微镜筛选板；
158.2)将每个孔的孢子发芽与对照板孔(含有活性杀真菌剂或0.5％dmso溶液的孔)的孢子发芽进行比较；
159.3)在excel表格中报告孢子萌发：
160.类型1，如果孢子已经正常发芽(正常的管伸长)；
161.类型2，如果孢子萌发芽不良或以任何方式不正常(发芽管很短，发芽孢子的频率低，管损坏)；
162.类型3，如果孢子根本没有发芽(健全的孢子，没有管)。
163.4)计算每种材料的分数2或3的重复次数；
164.5)计算每种材料的分数2和3之和；
165.6)最佳分数：重复次数＝4，分数总和＝12
166.结果：请参见实例6。
167.实例2：基于微孔板的新补骨脂异黄酮对立枯丝核菌生物活性测定
168.概述：将稀释后的已纯化的新补骨脂异黄酮添加至微孔板孔中，并与50ul菌丝悬浮液混合，从混合的菌丝开始，通过读板仪和目视检查监测真菌的生长。
169.材料：pdac、pdbc、dmso。
170.设备：读板仪、离心机、振荡器、培养箱。
171.方法：
172.立枯丝核菌菌丝接种物的制备：
173.在pdac 90mm培养皿中培养丝核菌，在1天-4天内获得生长的菌丝；
174.将50ml的pdbc培养基添加250ml无菌锥形瓶中；。
175.通过手术刀将固体培养基切成若干小块，并且将该若干小块插入至锥形瓶中；
176.用振荡器在27℃和150rpm的温度下培养2天-4天；
177.丢弃液体，并且将菌丝倒在空培养皿上；
178.用手术刀从菌丝上切下许多小块，并且然后将它们插入装有50ml的pdbc培养基的250ml无菌锥形瓶中；
179.准备4个培养瓶，并在27℃以150rpm的速度振荡培养3天；
180.将培养物在冰箱中冷藏1小时；
181.将冷培养物倒入250ml烧杯中；
182.添加20ml冷pdbc，使得混合物就能盖住搅拌刀；
183.用搅拌器在冰上以最大速度搅拌培养物2分钟，上下移动搅拌器若干次；
184.把混合物放在冰上；
185.将约5ml混合的混合物转移至15ml冰上的管中；
186.在冰上均质化15ml管中的培养物2分钟，根据需要上下移动试管；
187.如上所述，匀质化若干批5ml以制备所需的量(5ml的匀质化的培养物将制成约100ml接种物)；
188.将匀浆的一部分稀释10倍，以检查匀浆的浓度；悬浮液的浓度应为4x 104cfu/ml(稀释10倍后的浓度应为4000cfu/ml)；
189.在pdbc以1:20稀释接种物储备，在20ml中稀释1ml，或计算所需的稀释度，以制备2000cfu/ml的最终浓度；每个孔中的量应为100cfu。
190.活性实验的微孔板制备：
191.1)从-20℃冰箱中取出带有材料的板，并且在台面上解冻至少20分钟；
192.2)使用多吸管向微孔板的孔中添加50ul菌丝悬浮液，通过手用力混合孢子悬浮液，并倾析一个板(5ml)所需的量，以保持菌丝良好悬浮；
193.3)用透明密封剂密封板；
194.4)以2000rpm振荡板10分钟，以混合新补骨脂异黄酮和菌丝悬浮液；
195.5)将所有板在1000rcf下离心1秒，并停止收集板底部的液体；
196.6)将微孔板保持在台面上，直到被读板仪读取；
197.7)使用读板仪读取板；
198.8)收集台面上的板；
199.9)将已收集的板插入至带布盖的塑料盒中，并将盒子放入27℃的培养箱中；
200.板的筛选：
201.1)另外3个日期的筛板：试验开始后的第3天、第7天、第14天和第21天；
202.2)计算每个筛选与零点读数之间的吸光度差异；
203.3)计算每个时间点每个孔的生长抑制百分比使用对照板的dmso处理结果作为100％生长。
204.结果：请参见实例6。
205.实例3：基于微孔板筛选从植物中纯化的对瓜果腐霉具有潜在生物活性的化合物
206.概述：将稀释后的已纯化的新补骨脂异黄酮添加至微孔板孔中，并与pdbc悬浮液中的50ul的游动孢子混合，并且通过读板仪和目视检查来监测真菌从游动孢子开始的生长。
207.材料：sch、pdbc、dmso。
208.设备：读板仪、离心机、振荡器、培养箱。
209.方法：
210.腐霉属菌丝接种物的制备：
211.将瓜果腐霉在90mm培养皿中的sch上生长，以获得产孢菌丝。每个板将产生50ml的游动孢子悬浮液，这将产生10个96孔板；
212.将60ml的无菌h2o添加至250ml锥形瓶中；
213.通过手术刀将2个板的固体培养基切成12块(每个板)，并将其插入至锥形瓶(固体块应被水覆盖)中；
214.让菌丝在17℃下形成孢子过夜；
215.用手振荡锥形瓶以悬浮游动孢子；
216.用16层纱布将悬浮液过滤至50ml的试管中；
217.将悬浮液转移至500ml无菌瓶中；
218.丢弃固体并用次氯酸盐消毒锥形瓶；
219.在冰上冷却游动孢子悬浮液；
220.评估悬浮液中游动孢子的浓度(浓度应为1000-4000孢子/毫升)；
221.如果需要，用无菌冰箱冷真流水将悬浮液在500ml无菌瓶中稀释；
222.添加相同体积(与悬浮液相同)的无菌冰箱冷藏2:pdbc以获得500-2000孢子/毫升接种物，此稀释将导致每个孔中有25-100个游动孢子；
223.将游动孢子接种物保持在冰上。
224.活性实验的微孔板制备：
225.1)从-20℃的冰箱中取出带有新补骨脂异黄酮的板，并且在台面上解冻至少20分钟；
226.2)使用多吸管向微孔板的孔中添加50ul的游动孢子悬浮液接种物。通过手用力混合孢子悬浮液，并倾析一个板(5ml)所需的量，以保持游动孢子良好悬浮；
227.3)用透明密封剂密封板；
228.4)以2000rpm振荡板10分钟，以混合新补骨脂异黄酮和菌丝悬浮液；
229.5)将所有板在1000rcf下离心1秒，并停止收集板底部的液体；
230.6)将微孔板保持在台面上，直到被读板仪读取；
231.7)使用读板仪读取板；
232.8)收集台面上的板；
233.9)将已收集的板插入至带布盖的塑料盒中，并将盒子放入27℃的培养箱中。
234.板的筛选：
235.1)读出另外3个日期的板：试验开始后的第3天、第7天、第14天和第21天；
236.2)计算每个读出与零点读出之间的吸光度差异；
237.3)计算每个时间点每个孔的生长抑制百分比，使用对照板的dmso处理结果作为100％生长；
238.4)准备一个表格，列出在所有4次重复中重复的命中结果，为每个时间点设置一列。
239.结果：请参见实例6。
240.实例4：基于微孔板筛选对核盘菌具有潜在生物活性的化合物
241.概述：将稀释后的已纯化的新补骨脂异黄酮添加至微孔板孔中，并与50ul菌丝悬浮液混合，从混合的菌丝开始，通过目视检查监测真菌的生长。
242.背景：核盘菌是属于子囊菌的真菌，并且是一种土壤传播的病原体。核盘菌很难产生大量的孢子，这导致在此筛选中决定使用菌丝而不是孢子进行接种。
243.材料：pdbc、pda、pdat、pdbt、dmso。
244.设备：离心机、振荡器、培养箱。
245.方法：
246.核盘菌菌丝接种物的制备：
247.在21℃的管中于pda种植菌核病菌4天；
248.转移琼脂块，并在21℃的90mm培养皿中，在pdat种植菌核病菌，3天内长出菌丝；
249.将50ml的pdbt培养基添加250ml无菌方瓶中；
250.用手术刀将固体培养基切成15个非常小的块(1x 5mm)，并将其插入方形烧瓶中；
251.使用振动器在21℃和130rpm的温度下培养2天；
252.丢弃液体，并且将菌丝倒在空培养皿上；
253.使用手术刀从菌丝上切下许多小块(避免使用琼脂块)，并将它们插入至含有50ml的pdbt培养基的250ml的无菌方瓶中；
254.在21℃下生长2天，以130rpm振荡，获得快速生长的分散菌丝；
255.将培养物在冰箱中冷藏1小时；
256.将冷培养物倒入50ml管中；
257.把混合物放在冰上；
258.将约5ml混合的混合物转移至15ml冰上的管中；
259.在将15ml管中的培养物均质化2分钟，同时根据需要上下移动试管(应形成小的分支块)；
260.如上所述，匀质化若干批5ml以制备所需的量(5ml的匀质化的培养物将制成约50ml接种物)；
261.将匀浆的一部分稀释10倍，以检查匀浆的浓度，悬浮液的浓度应为2x 104cfu/ml(稀释10倍的浓度应为2000cfu/ml)；
262.在pdbc以1:10稀释接种物储备，在20ml中稀释2ml，或计算所需的稀释度，以制备2000cfu/ml的最终浓度；每个孔中菌丝的最终数量应为100cfu。
263.活性实验的微孔板制备：
264.1)从-20℃的冰箱中取出带有新补骨脂异黄酮的板并且在台面上解冻至少20分钟；
265.2)向微孔板的孔中添加50ul菌丝悬浮液，通过手用力混合孢子悬浮液，并倾析一个板(5ml)所需的量，以保持菌丝良好悬浮；
266.3)用透明密封剂密封板；
267.4)以2000rpm振荡板10分钟，以混合新补骨脂异黄酮和菌丝悬浮液；
268.5)将所有板在1000rcf下离心1秒，并停止收集板底部的液体；
269.6)收集台面上的板，直至所有微孔板准备好培养；
270.7)将微孔板插入至塑料盒中，并将该盒放入21℃的培养箱中。
271.板的筛选：
272.1)5个日期的筛板：接种后第4天、第7天、第14天和第21天；
273.2)使用灯对化合物对真菌生长随时间推移的影响进行视觉评估；
274.3)移除筛选板的盖后，如果盖上有液体(从内部)，用加热块在60℃下蒸发液体；
275.4)将每个孔的菌丝生长与对照板孔(含有活性杀真菌剂或0.5％dmso溶液的孔)的菌丝生长进行比较；
276.5)将结果写在特殊的表格上：透明孔＝3(无菌丝生长)，正常菌丝结构＝1(正常生长)，不确定＝2(非预期类型的固体结构，或部分覆盖该区域)。
277.实例5：基于微孔板筛选对丁香假单胞菌具有潜在生物活性的化合物
278.概述：将稀释的纯化后的新补骨脂异黄酮添加至微孔板孔中，并与100ul的冷冻细菌悬浮液混合，并通过目视检查监测细菌的生长。
279.背景：假单胞菌是一种杆状革兰氏阴性细菌。60％甘油的冷冻细菌储备被用作筛选实验的接种物。
280.材料：lb、lba、dmso。
281.设备：离心机、振荡器、培养箱。
282.方法：
283.假单胞菌悬浮液制剂：
284.1)在28℃的lba板上培养假单胞菌2天以获得单个菌落；
285.2)用无菌牙签将单个菌落转移至含有5ml lb的50ml无菌管中，并在28℃和150rpm下生长24小时；
286.3)将管在冰箱中冷藏1小时；
287.4)向管中添加7.5ml冰箱冷藏的无菌甘油溶液，得到60％甘油溶液；
288.5)混合均匀，但要轻柔，以获得完美的混合-使用1000rpm的涡流；
289.6)将100ul含60％甘油的细菌悬液等分至1.5ml管中，每个等分应产生足以筛选10个微孔板的量；
290.7)将细菌悬浮液储存在-20℃的60％甘油中。
291.用于筛选的假单胞菌悬浮液制剂：
292.1)从冰箱中取出1.5ml的含有100ul冷冻假单胞菌悬浮液的管，并在冰上解冻；
293.2)在通风橱中制备50ml管和40ml冷藏lb；
294.3)将40ul细菌悬浮液与40ml冰箱冷藏lb混合在50ml管中，此量足以进行10个微孔板的活性筛选；
295.4)使用此悬浮液进行筛选实验。
296.活性实验的微孔板制备：
297.1)从-20℃的冰箱中取出带有新补骨脂异黄酮(10ul)的板，并且在台面上解冻至少20分钟；
298.2)使用多吸管向微孔板的每个孔中添加80ul含生长培养基的细菌悬浮液；
299.3)用透明密封剂密封板；
300.4)以2000rpm振荡板10分钟，以混合新补骨脂异黄酮和细菌悬浮液；
301.5)将所有板在1000rcf下离心1秒，并停止收集板底部的液体；
302.6)将板插入至带盖的塑料盒中，并将盒子放入28℃的培养箱中。
303.微孔板的筛选：
304.1)在5个日期筛选微孔板：接种后第3天、第5天、第7天、第14天和第21天；
305.2)用灯目测评估细菌生长；
306.3)准备用于筛选的板：以2000rpm振荡板2分钟以悬浮细菌，然后以1000rcf离心板几秒钟；
307.4)移除筛选微孔板的盖后，如果盖上有液体(从内部)，用加热块在60℃下蒸发液体；
308.5)将每个孔的透明度与对照孔(含有对照杀菌剂或0.5％dmso溶液的孔)的透明度进行比较。
309.将结果写在特殊的表格上：透明＝3(没有细菌生长)，混浊＝1(正常细菌生长)，不确定＝2(与在0.5％dmso溶液中生长相比，浊度非常低)。
310.结果：请参见实例6。
311.实例6：基于实例1至实例5的方案的体外实验结果。
312.体外筛选基质
313.针对11种农业害虫(如下表中所指示的)对新补骨脂异黄酮进行筛选。生物活性值以％为单位，并且反映了根除目标害虫的潜力。
314.生物活性相对值计算规则(以最大值的百分比表示)
315.a.马铃薯晚疫病菌,马铃薯晚疫病菌-活性等级(1/2/3)x重复#/12(最大值3x 4＝12)*100；
316.b.丁香假单胞菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、瓜果腐霉-活性等级(1/2/3)x重复#x活性天数/252(最大值3x 4x 21＝252)*100；
317.c.葡萄孢菌-活性等级(1/2/3)x重复#x活性天数/168(最大值3x 4x 14＝168)*100；
318.d.果胶杆菌-活性等级(1/2/3)x重复#x活性天数/84(最大值3x 4x 7＝168)*100。
[0319][0320]
总之，新补骨脂异黄酮是一种有效防治下列害虫的杀虫剂：柄锈菌(第一阳性结果在下文植物内结果章节中提供)、立枯丝核菌、瓜果腐霉、核盘菌和丁香假单胞菌。
[0321]
实例7：用于活体转化法验证的调配物准备
[0322]
调配物1(化合物：二甲基亚砜)
[0323]
为了有助于化合物溶解至最终工作浓度并将其在喷涂表面上方扩散，首先将干重的新补骨脂异黄酮以1:9的比例溶解在二甲基亚砜溶剂中，并且然后用双蒸水使其达到用于验证的最终体积。喷洒前，将非离子洗涤剂吐温20添加至最终浓度为0.05％。
[0324]
调配物2(化合物：吐温20：乙醇)
[0325]
为了有助于化合物溶解至最终工作浓度并在喷涂表面上方扩散，首先将干重的新补骨脂异黄酮以1:8的比率溶解在无水乙醇中，超声处理5分钟，并且然后添加另一份非离子洗涤剂吐温20以最终确定调配物。喷洒前，添加另外量的0.05％吐温20(不考虑之前添加的吐温20的量)。
[0326]
将希格诺作为含有500ppm浓度的商业调配物的水悬浮液喷洒在叶上，用于悬浮液制备。
[0327]
将0.5g的可商购获得的调配物用ddw稀释至1000ml，并剧烈混合。
[0328]
调配物3：(化合物：二甲基亚砜：黄原胶：喜威(silwet)l-77)
[0329]
将nbi溶解在二甲基亚砜中，得到10％的溶液。为了得到最终的调配物，添加双蒸馏水(ddw)至nbi的最终工作浓度(400ppm)。为了改善喷雾分子向表面的递送并确保活性成分的适当吸收，将佐剂(黄原胶，0.04％)和表面活性剂(喜威l-77，0.06％)添加至调配物中。
[0330]
调配物4：(化合物：水：黄原胶：喜威(silwet)l-77)
[0331]
nbi在ddw使用研磨机研磨成细粉(获得1％的悬浮液)。为了得到最终的调配物，添加ddw直至获得nbi的最终工作浓度-400ppm。为了改善喷雾分子向表面的递送并确保活性成分的适当吸收，将佐剂(黄原胶，0.04％)和表面活性剂(喜威l-77，0.06％)添加至调配物中。
[0332]
实例8：玉米的活体转化法验证
[0333]
协议名称：玉米幼苗感染锈菌试验
[0334]
概述：玉米接种，孢子悬浮液的收集、制备和玉米锈病菌的材料活性研究。
[0335]
方法:
[0336]
接种用玉米幼苗的制备
[0337]
1)使用120x 80x 80mm的盆；
[0338]
2)使用标准花园土壤和肥料；
[0339]
3)使用锈敏感品种的玉米种子；
[0340]
4)把盆放在托盘里；
[0341]
5)用泥土填充盆，直到顶部；
[0342]
6)为种子做一个小槽；
[0343]
7)在每个盆中种植大约10粒玉米种子；
[0344]
8)用另外的土壤覆盖种子；
[0345]
9)在托盘中添加水，每个盆约100ml(填充托盘三次)；土壤应湿润并且24小时后托盘中不应有水；
[0346]
10)玉米在22℃的生长室中生长8天(直至第二片叶子出现)。
[0347]
从玉米叶制备孢子悬浮液用于接种：
[0348]
1)将20片带有孢子的已感染的玉米叶插入50ml无菌管中；
[0349]
2)添加50ml冷藏的0.05％吐温20溶液；
[0350]
3)将管插入密封的、冰冷却的塑料盒中；
[0351]
4)使用振荡器以3000rpm振荡盒子15分钟；
[0352]
5)将悬浮液(不带叶)转移至干净的无菌50ml管中；
[0353]
6)将孢子悬浮液通过16层纱布过滤到另一个无菌的50ml的管中；
[0354]
7)将带有孢子悬浮液的试管放在冰上；
[0355]
8)在5微米滤膜上清洗并浓缩孢子；用冰冷无菌水洗涤4次，并且收集0.05％吐温20溶液中的孢子；
[0356]
9)接种时，用冷的0.05％吐温20溶液稀释孢子悬浮液，使孢子浓度达到8000个孢子/毫升。
[0357]
生长室实验：
[0358]
使用如上所述制备的8天龄幼苗；
[0359]
准备喷洒处理-每株大约1ml；
[0360]
将吐温20添加到处理中，最多添加0.05％；
[0361]
对叶进行喷雾处理，直到完全饱和(使用喷雾瓶)，并在生长室中晾干；
[0362]
第二天重复喷雾，并让其变干；
[0363]
在第二天(处理喷雾约4小时后)，用柄锈菌孢子悬浮液接种植物；
[0364]
用喷雾瓶向9日龄玉米幼苗的叶片上喷洒约1ml(直至完全饱和)的孢子悬浮液；
[0365]
将装有接种苗的盆放在底部有热水的黑暗潮湿腔室里。腔室应保持在22℃、湿度为99％的房间中24小时(热水温度应为32℃)；
[0366]
24小时后，将盆转移至生长室；
[0367]
在22℃的生长室里种植玉米；
[0368]
接种后7天，叶片上会出现褐色斑点；
[0369]
接种9天后记录锈菌褐斑病的叶片覆盖率；
[0370]
比较处理过的幼苗和水处理过的幼苗的叶片覆盖率。
[0371]
结果
[0372]
我们在生长室的受控环境下进行了5个独立实验，在这些实验中，我们评估了新补骨脂异黄酮(nbi)在玉米植株中防止和控制玉米锈病菌的潜力(图1、图2、图3、图4和图5)。在受控生长条件下的五个独立实验中，新补骨脂异黄酮表现非常好，并显示出非常好的疗效。新补骨脂异黄酮在200ppm时的平均防治效果为87.39％，400ppm时的平均防治效果为91.94％，800ppm时的平均防治效果为94.07％。
[0373]
实例9：小麦的活体转化法验证
[0374]
小麦散黑粉叶锈菌侵染的小麦实验
[0375]
实验描述：用锈敏小麦品种种子进行实验。幼苗在没有小麦柄锈菌的温室中生长。第一次处理在7天播种阶段进行。用两种浓度的新补骨脂异黄酮和相应的对照处理(200ppm和400ppm)处理幼苗。第二次施用在24小时后进行，同时植物在24℃的温控室内干燥。让植物在24℃的温控室内再次干燥2小时，并且然后用小麦条锈菌接种。幼苗在湿度室中培养24小时，以允许感染的发展，然后转移到温度控制的温室中，直到实验结束。接种后12天评估疾病严重程度。
[0376]
接种方案：通过喷洒孢子悬浮液将小麦散黑粉叶锈菌引入幼苗。矿物油中的孢子悬浮液(2.3mg/ml)喷洒在幼苗上-每盆250微升，含20株幼苗。
[0377]
施用新补骨脂异黄酮：已调配的新补骨脂异黄酮(调配物1和2)和相应对照以水悬浮液的形式施用。每种处理含有4个盆，其中每个盆中有20株幼苗，每2次施用喷洒20ml以进行处理。此施用量足以达到叶的排水。
[0378]
疾病严重程度和细胞毒性评估：接种后12天评价结果。每个处理含有4个盆，每盆20株幼苗。通过视觉评估分别评估每个盆，并计算处理的平均值(平均4个盆)。根据0-5级锈菌覆盖率评估疾病严重程度：完全没有覆盖-0，100％的叶面积覆盖锈菌-5。
[0379]
治疗的细胞毒性根据叶边缘0-3级烧伤进行评估：完全没有烧伤-0，所有叶边缘烧伤-3。
[0380]
治疗：对不同浓度的新补骨脂异黄酮进行了评估，并将其溶解在dmso中。其它治疗包含以下：
[0381]
1.水(未处理的)；
[0382]
2.每种处理的调配物成分(dmso)适用于最高浓度。
[0383]
活体转化法验证实验的统计分析：为了评估化合物在受感染植物中与对照植物(受感染但未处理)相比的效果，通过学生的t测试分析数据并计算p值。每个实验的最小重
复次数是3次。如果p＜0.05，则认为结果有意义。
[0384]
结果
[0385]
我们在温室中进行了3个独立的实验，在这些实验中，我们评估了新补骨脂异黄酮(nbi)在小麦植株中防止和控制小麦叶锈菌的潜力(图6)。图6中的每个条形代表每次处理四次重复的平均值。新补骨脂异黄酮通过以下功效控制叶锈病：200ppm时介于30％至50％之间，400ppm时介于30％至40％之间。在生长室条件下的受控温度下进行了另一项实验(图7)，其中新补骨脂异黄酮在200ppm时控制小麦叶锈病的效力高达40％。
[0386]
实例10：小麦的活体转化法验证
[0387]
小麦条锈病侵染的小麦实验
[0388]
小麦的活体转化法验证：我们进行了两项独立的田间试验，在这些试验中，我们评估了新-补骨脂异黄酮(nbi)在用治疗方法防止和控制来自若干不同品种的小麦植株中的小麦条锈病(黄锈病)的潜力。实验在以色列的两个独立地点进行，有不同的天气和降雨条件(600mm-300mm雨/季；平均季节温度：每天19-20℃，每晚10-13℃)。
[0389]
通过测定两个不同的参数来确定nbi对小麦条锈病叶感染的影响：(a)真菌覆盖的相对叶面积；和(b)在小麦叶上形成的脓包中锈菌的夏孢子的视觉能力和量。
[0390]
(a)在处理后的第0天、第7天和第14天(实验102)或第0天和第7天(实验108)测定nbi(调配物3和4)对小麦条锈病感染小麦叶强度的影响。叶感染强度是相对于未处理叶中真菌覆盖率计算的。所有其它处理都是相对于参考处理“希格诺”(吡唑醚菌酯+啶酰菌胺)进行评估的。
[0391]
验证现场实验中显著性的统计分析：为了评价化合物在用nbi处理的受感染植物中的效果，仅调配物或未处理的植物(受感染但未处理)，通过学生t测试分析数据并计算p值。如果p＜0.05，则认为结果有意义。一个星号、两个星号或三个星号(*、**、***)表示显著性，p＜0.05、0.01、0.001，而n.s表示与未处理的对照相比不显著。
[0392]
(b)(调配物4)对通过喷洒施用杀真菌剂后第0天和第7天取样的小麦叶上形成的脓疱中锈菌尿孢子量的影响(这仅在实验108中评估)。小麦叶在田间取样，并保持在高湿度和低温下，直到观察到。为了定量分析，在小麦的五片叶中各取样四个脓疱。在上部光源的光学显微镜下观察叶。计数每个选定脓疱中维持完整的孢子和塌陷的孢子。计算塌陷孢子的百分比。
[0393]
统计分析采用anova方差测试使用0.95置信水平完成。
[0394]
为了改善喷雾分子向表面的递送并确保活性成分的适当吸收，将佐剂(黄原胶，0.04％)和表面活性剂(喜威l-77，0.06％)添加至nbi溶液中以生成调配物3和4。
[0395]
结果：
[0396]
表2田间处理小麦叶上黄(条)锈夏孢子的观察(实验108)
[0397][0398]
(a)nbi控制的黄锈，其功效为：在处理后第7天和第14天，分别使用调配物3和调配物4，在400ppm时，介于60％至80％之间。我们假设小麦植株不同田间试验中nbi效应的差异可以用特定田间条件下随季节的可变性来解释(图8和图9(分别为试验102和108))。图8中的每个条形代表每次处理30次重复的平均值。
[0399]
(b)在第0天取样的叶上观察到黄锈脓疱。在第0天，nbi显著减少了单个脓疱中的尿胞数量。
[0400]
在测试的化学物质中，塌陷孢子的百分比类似。在第0天，受试杀真菌剂中孢子的塌陷明显高于水处理对照(表2)。
[0401]
总结
[0402]
nbi显著降低了真菌覆盖的相对叶面积。
[0403]
nbi显著减少了病原体在其产生的脓疱中的孢子数量。
[0404]
在处理过的植物的叶子上孢子的塌陷率更高。
[0405]
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