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类器官固定剂、其应用和类器官组织切片的制备方法与流程

花匠小妙招
2025-09-18 14:29

本发明属于类器官组织切片制备，具体涉及一种用于类器官组织切片制备中固定类器官的固定剂，以及该类器官固定剂在类器官固定以及制备类器官组织切片中的应用，同时公开了基于该类器官固定剂进行的类器官组织切片的制备方法。

背景技术：

1、类器官(organoids)是一种在体外通过三维(3d)培养技术形成的微型器官模型，主要来源于干细胞或成体组织，它们具有自我更新和自我组织的能力，并能够高度模拟体内相应器官的结构和功能，因此，类器官在疾病研究、药物开发、再生医学等领域均具有重要意义。

2、目前，研究和分析类器官的方法主要是类器官切片，其将3d培养的类器官切成薄片，在保留类器官结构完整性和生物活性的同时，为后续的分子生物学、组织化学及病理学分析提供了重要的支持。具体的操作流程一般包括使用特定试剂盒培养类器官，然后进行固定、抗冻保护、包埋、速冻和冷冻切片等一系列步骤，以制备成类器官组织切片。这种技术特别是在脑类器官中应用较多，目的是减少组织损伤并保留关键抗原表位，从而更真实地重现复杂的中枢神经系统结构。

3、在类器官切片过程中，固定方法直接影响了切片的质量和后续实验结果的可靠性。目前，类器官切片固定方法主要包括化学固定法和物理固定法两大类，比较常用的化学固定法是通过化学试剂(如醛类、非醛类、丙酮及醇类等)与组织中的有机和无机成分发生反应，使其凝固或沉淀，从而保持组织的形态和结构。其中，以中性缓冲液配制的多种聚甲醛固定剂最为常用，甲醛分子能够穿透细胞膜，与组织内的自由氨基基团(如蛋白质中的氨基)发生化学交联形成一种网状结构，这种网状结构有助于保持细胞的形态和结构，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，从而保持组织原有的抗原性和生物学特性，并且甲醛分子能使组织中的蛋白质发生凝固，形成不溶性的蛋白质交联产物。这种凝固作用有助于保持组织的形态和结构，防止在切片和后续处理过程中发生变形和破坏。

4、但由于类器官由多种细胞类型组成，具有复杂的结构和功能，且不同细胞类型的硬度和韧性不同，在制样过程中会变得较为脆弱，使用多聚甲醛进行固定组织可能导致组织过度硬化或软化，从而影响切片操作，容易造成组织切片时破损严重，将无法提供高质量的样本，从而限制类器官在分子生物学、细胞生物学和病理学方面的研究。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的首要目的在于提供一种类器官固定剂，该类器官固定剂为合成高分子水凝胶成分，其具有稳定性好，与组织生物相容性高，且易与冷冻组织形成良好的结合，从而可以高效、稳定的固定类器官，能够有效的解决目前化学固定中存在的类器官组织切片破损的问题，提高类器官组织切片的质量和后续实验的可靠性。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的一个方面提供了一种类器官固定剂，其成分为合成高分子水凝胶，所述合成高分子水凝胶是由预聚液经聚合反应得到的，其中，所述预聚液中包括单体10～50wt％、交联剂0～5wt％和聚合引发剂0～10wt％，所述单体为丙烯酸衍生物。

4、本发明的另一个方面提供了上文所述的类器官固定剂在类器官固定或制备类器官组织切片中的应用。

5、本发明的另一个方面提供了一种类器官组织切片的的制备方法，包括以下步骤：

6、将上文所述的类器官固定剂置于3～5℃下预冷；

7、将待固定的类器官清洗后，将其放置在所述类器官固定剂中进行固定；

8、清洗去除残留的类器官固定剂，对类器官进行脱水；

9、将脱水后的类器官周围的液体吸干后，包埋成块；

10、将包埋块切片，制得类器官组织切片。

11、本发明中采用的合成高分子水凝胶是一类具有三维网络结构的亲水性高分子材料，其具有优异的稳定性和生物相容性，这种结构使得水凝胶能够吸收和保持大量的水分，高吸水性有助于在切片过程中保持组织的湿润状态，减少切片过程中的形变和损伤。

12、具体的说，对于一些质地较为柔软的类器官，由于自身含有较多的水分，在制样过程中容易形成冰晶，并增加组织的脆性，从而在切片时容易破损；而本发明提供的合成高分子水凝胶是具有三维网状结构的亲水性聚合物材料并以水为分散介质的凝胶，其能够吸收并调控水分，同时其三维结构和生物相容性可以为类器官提供支撑作用。因此，加入本发明中的合成高分子水凝胶固定剂有以下作用：第一，支撑作用：在进行切片时，类器官需要被固定在适当的介质中以保持其完整性和形态，水凝胶由于其柔软且具有一定形状的特性，能够紧密地包裹类器官，为其提供稳定的支撑，防止在切片过程中发生形变或损坏；第二，保护作用：水凝胶的网状结构能够吸收调控水分，这有助于在切片过程中减少冰晶的形成，从而降低对类器官的机械损伤；同时，水凝胶还能够防止类器官在制样过程中的干燥和收缩，保护其内部结构的完整性；第三，改善切片质量：增加水凝胶的交联密度可以提高其机械强度，使其更好地支撑类器官，可以进一步改善切片的质量。

13、总的来说，采用本发明中的类器官固定剂可以制备得到高质量的类器官组织切片，保证后续切片处理和分析的可靠性和准确性。

14、本发明的有益效果：

15、本发明的类器官固定剂为合成高分子水凝胶成分，其稳定性和生物相容性好，利用其在类器官组织切片制备阶段对类器官进行固定，其能够通过水凝胶的三维结构和生物相容性为类器官提供支撑作用，从而有效的减少类器官在切片过程中的移动和变形，避免切片制备过程中造成的组织破损，极大的保持了类器官组织的完整性，以获得高质量的类器官组织切片，保证了后续的切片处理和分析的可靠性和准确性。

技术特征：

1.一种类器官固定剂，其特征在于，其成分为合成高分子水凝胶，所述合成高分子水凝胶是由预聚液经聚合反应得到的，其中，所述预聚液中包括单体10～50wt％、交联剂0～5wt％和聚合引发剂0～10wt％，所述单体为丙烯酸衍生物。

2.如权利要求1所述的类器官固定剂，其特征在于，所述丙烯酸衍生物为丙烯酰胺、丙烯酸盐、丙烯酸酯中的至少一种；

3.如权利要求1所述的类器官固定剂，其特征在于，所述交联剂为双丙烯酰胺、聚碳化二亚胺、纳米黏土、聚乙二醇二丙烯酸酯、壳聚糖、明胶中的至少一种；

4.如权利要求1所述的类器官固定剂，其特征在于，所述预聚液中还包括醛类有机物；

5.如权利要求1-4任一项所述的类器官固定剂在类器官固定或制备类器官组织切片中的应用。

6.一种类器官组织切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的类器官组织切片的制备方法，其特征在于，所述类器官的固定是在3～5℃条件下固定1h。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述脱水依次采用质量浓度为15％和30％的蔗糖溶液梯度进行。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述包埋成块的步骤为：向类器官加入包埋试剂后，在20～30℃下放置10～20min后于-80℃冷冻成块。

10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述包埋块切片前，还包括将组织包埋块在-20℃～-30℃平衡的步骤。

技术总结
本发明公开了一种类器官固定剂、其应用和类器官组织切片的制备方法，该类器官固定剂的成分为合成高分子水凝胶，所述合成高分子水凝胶是由预聚液经聚合反应得到的，其中，所述预聚液中包括单体10～50wt％、交联剂0～5wt％和聚合引发剂0～10wt％，所述单体为丙烯酸衍生物。本发明中提供的类器官固定剂和类器官组织切片的制备方法，可得到结构形态完整、稳定且高质量的类器官组织切片，为后续类器官组织切片分析和处理的可靠性和准确性提供保障。

技术研发人员：韩俊辉,王浩,毕丹蕾,吴萍,尹芳芳
受保护的技术使用者：合肥综合性国家科学中心人工智能研究院（安徽省人工智能实验室）
技术研发日：
技术公布日：2025/3/24