首页 > 分享 > 基于ssr标记的野生毛花猕猴桃种质资源遗传多样性分析.docx

基于ssr标记的野生毛花猕猴桃种质资源遗传多样性分析.docx

花匠小妙招
2025-09-18 18:54

基于ssr标记的野生毛花猕猴桃种质资源遗传多样性分析

杏仁是中国的一种杏仁精。相对于庞大的野生种质资源,猕猴桃的栽培品种只占了很小的一部分。目前猕猴桃品种选育主要还是通过从野生资源中选择或杂交育种(黄宏文等,2000)。丰富的野生猕猴桃种质资源是猕猴桃品种选育和产业可持续发展的基础(Huangetal.,2004;Ferguson&Huang,2006)。目前商业化栽培利用的猕猴桃主要是美味猕猴桃和中华猕猴桃(刘磊等,2013),而毛花猕猴桃(ActinidiaerianthaBenth.)多处于野生状态,生产实践中推广应用的毛花猕猴桃品种极少(张佳佳等,2011)。毛花猕猴桃果实AsA含量较高(5.00~13.79mg·g-1FW),是中华猕猴桃的3~4倍(钟彩虹等,2011)。毛花猕猴桃作为中国特有的野生种质,广泛分布于云南、广西、贵州、湖南、江西、福建和浙江。通过对野生毛花猕猴桃种质资源进行果实表型性状及SSR遗传多样性分析的研究,可了解其种内的遗传背景,选择优良的育种亲本材料,提高育种效益。Weising等(1996)研究发现二倍体中华猕猴桃的大多数SSR位点拥有较高的杂合度。Huang等(1998)用20个SSR位点研究发现二倍体和四倍体中华猕猴桃表现出很高的杂合度,在DNA水平上的多倍体猕猴桃具有更丰富的多样性。Cipriani等(2002)用SSR标记在对猕猴桃进行遗传图谱构建时寻找到了控制果实质量的数量性状位点连锁的标记。Tsetolin等(1997)采用“假测交”的作图技术,挑选中华猕猴桃和硬齿猕猴桃杂交后代对251个标记进行筛选,获得了105个SSR位点,应用SSR和RFLP标记构建了猕猴桃遗传连锁图谱。本研究中通过对江西武功山境内的野生毛花猕猴桃进行实地调查和资源收集,在对果实表型性状分析的基础上,采用SSR标记技术对野生毛花猕猴桃进行遗传多样性分析,旨为其优异基因发掘利用和野生株选优及其遗传育种工作提供理论依据。1材料和方法1.1幼叶和果实的测定2012年7—8月对江西省武功山境内的野生毛花猕猴桃种质资源进行了普查,供试材料为随机采集的70份野生毛花猕猴桃种质的幼叶和果实,用冰盒保存并运回实验室,置于–20℃超低温冰箱中保存备用。每份毛花猕猴桃种质随机选取10个果实,根据UPOV(国际植物新品种保护联盟)公布的猕猴桃属品种测定标准(UPOV,2012)对果实的8个表型性状(表1)进行测定和评价。所有的表型性状的测定结果按照UPOV标准进行分类和采用NTSYS-pc2.1进行赋值转换成表型数据矩阵。1.2毛花猕猴桃基因组中ssr扩增和扩增采用CTAB法提取样品幼叶基因组DNA,用紫外分光光度计检测DNA质量和浓度,–20℃保存备用。参照Testolin等(2001)构建的猕猴桃SSR遗传连锁图谱,选用广泛分布于中华猕猴桃基因组中的70对SRR引物(Palombi&Damiano,2002;Zhengetal.,2004;Korkovelosetal.,2008),首先随机选择8份野生毛花猕猴桃种质材料进行扩增,筛选出多态性较好的21对SSR引物,再对70份野生毛花猕猴桃种质资源进行扩增。PCR扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性45s,50~60℃退火45s,72℃延伸45s,30个循环;72℃延伸10min。扩增产物10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,快速银染法染色。1.3同迁移率的统计对果实表型性状赋值后,采用Excel2007进行频率分析。根据SSR分析的结果,将每条SSR引物扩增出的每一条带视为1个位点,相同迁移率的记为1,无条带的记为0,统计等位位点数、多态性位点数和多态性信息含量(PIC)参数值,不具多态性的条带不予统计。采用NTSYS-pc2.1软件计算野生毛花猕猴桃的遗传距离并按照非加权配对平均法(UPGMA)和SHAN程序进行聚类分析,并对聚类分析得到的果实表型性状欧式距离矩阵和SSR标记遗传距离矩阵进行Mantel相关性检测(Lapointe&Legendre,1992)。2结果与分析2.1不同品种毛花猕猴桃结果特性聚类分析调查结果(表1)表明,70份野生毛花猕猴桃的果实形状变化丰富,果实形状以圆柱形居多(49%),其次为椭圆形(37%)和圆形(14%);果心横截面有圆形、扁圆形和横向椭圆形,所占比例分别为27%、32%和41%;果实横截面以圆形居多(61%),扁圆形和横向椭圆形所占比例分别为23%和16%;果基形状以微倾斜(74%)为主,果实倾斜则占26%;果顶形状除了圆形所占比例为41%外,其它微凸和深凸所占比例分别为37%和22%;毛被颜色为白色和棕色,各占50%。根据果实的表型性状对野生毛花猕猴桃进行UPGMA聚类分析,70份野生毛花猕猴桃资源分为3个组(图1)。A组属于果实圆形和椭圆形混合组,果基形状微倾斜,毛被白色和棕色混合分布。A组又可以分为两个亚组:A-1亚组果实横径宽,纵径短,果心横截面椭圆形,果实横截面扁圆或椭圆形,果顶圆形;A-2亚组果实的横径中等或窄,纵径中等,果心横截面圆形或扁圆形,果实横截面圆形,果顶微凸。B组果实椭圆形,纵径短,果顶微凸,毛被为白色。C组果实圆柱形,果实的纵径长,果心横截面椭圆形,果基性状倾斜,果顶深凸,毛被白色和棕色混合分布。C组又分为两个亚组:C-1亚组果实的横径中等,果实横截面圆形;C-2亚组果实横径窄,果实横截面扁圆。2.2ssr引物扩增多态性利用所选择的70对SSR引物对野生毛花猕猴桃种质进行分析,共筛选出21对多态性高的SSR引物,通过对70份野生毛花猕猴桃种质群体的扩增,并对等位位点数、多态位点数以及多态性信息含量(PIC)等进行多样性统计(表2)。两对SSR引物扩增得到的基因片度长度在75~400bp,PCR总扩增总计得到127个等位位点,等位位点数在2~12之间,平均每对SSR引物可以检测到6.04个等位位点数。其中多态性位点最丰富的是引物UDK96-040,有12个等位位点变异,而引物UDK97-401只检测到了两个等位位点变异。多态信息含量(PIC值)变化范围为0.358~0.837,平均为0.691。2.3种质聚类分析通过21对多态性SSR引物分析,70份野生毛花猕猴桃种质材料的遗传相似系数(GS)变异范围为0.5306~0.9252,平均值为0.7805。其中种质66和68、种质45和53的GS值最大(0.9252),表明两者的亲缘关系很近,而种质25和47的GS值最小,说明两者的亲缘关系最远,两者的相似性只有为0.5306。根据材料间的遗传相似系数,采用UPGMA法对野生毛花猕猴桃种质进行聚类分析(图2),利用21对SSR标记能将70份野生毛花猕猴桃种质相互区分,在GS值在0.65水平上将所有的材料划分成Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共3个组。Ⅰ组包括了27份种质材料,包含了全部10份果实圆形的种质和17份的果实椭圆形的种质。Ⅱ组包括19份种质材料,果实形状主要为椭圆形,但也包括了5份的圆柱形的种质材料。Ⅲ组则包括了24份种质材料,种质的果实形状主要为圆柱形,同时也聚集了3份椭圆形的种质材料。圆形、椭圆形和圆柱形果实的种质都有各自聚类的趋势,但三者之间并没有完全分开。2.4线性关系分析结果为了解野生毛花猕猴桃果实表型性状的遗传多样性和SSR分子标记之间可能存在的内在联系,将野生毛花猕猴桃果实表型性状欧式距离矩阵和SSR标记遗传距离矩阵进行Mantel相关性分析,结果表明二者相关性达到极显著水平(r=0.814,P<0.01),两种分析方法得出的结果具有很大程度的吻合性。野生毛花猕猴桃不同单株之间在SSR标记遗传距离矩阵中亲缘关系的远近与果实表型性状变异的程度大致吻合,果实表型性状欧式距离矩阵中相距较近的单株之间其遗传距离也相对较小。3讨论3.1不同品种、不同表型性状下毛花猕猴桃生长情况近年来,对野生植物的遗传多样性和核心种质的研究是国内外研究的热点问题(马玉敏等,2008)。通过对野生居群的表型性状的调查和研究,不仅可以对野生资源进行科学有效地保护和合理地开发利用提供指导意义,而且还可以为推动保护生物学和遗传育种提供重要的理论基础。虽然野生毛花猕猴桃在中国多个省份有分布,但大多数是出于零星分布的状态,再加上人为的因素,毛花猕猴桃资源破坏很严重。本研究中对江西省武功山境内的野生毛花猕猴桃居群进行实地调查中发现,70份野生毛花猕猴桃种质资源集中分布在(N27°32′14′′,E114°07′22′′)至(N27°32′52′′,E114°07′47′′)之间,分布较集中,超出这一范围则所发现的野生毛花猕猴桃极少,基本处于零星分布状态。在猕猴桃种质资源进行评价和遗传育种工作中,果实的表型性状是一类十分重要的评价指标(黄宏文等,2000)。通过对收集的70份野生毛花猕猴桃果实表型性状的研究,发现毛花猕猴桃在野生状态下存在丰富的表型性状遗传多样性,如在果实形状、果实横径、果实纵径、果心及果实横截面形状、果基及果顶形状以及毛被的颜色等性状上都表现出了很高的多样性和差异性。同时,丰富的表型性状遗传多样性也为野生毛花猕猴桃的品种选育和遗传育种的亲本选择提供丰富的种质资源。因此,在对野生毛花猕猴桃资源进行野生选优工作中,发现具有优良的果实表型性状的单株,从中培育出适应性和抗性强、果实表型性状优良的毛花猕猴桃品种是今后研究工作的重点方向。3.2毛花猕猴桃ssr分子标记分析选择优良性状的亲本材料是进行猕猴桃育种工作的前提和基础,亲本材料遗传背景狭窄则会导致难以培育出优良性状的品种。因此,通过选择优良性状的亲本材料,比较材料间亲缘关系的远近,对于猕猴桃新品种的选育和品种改良工作具有重要的生产指导意义。利用SSR分子标记技术进行猕猴桃遗传多样性的研究,国内外已有相关报道。郑轶琦等(2003)利用9对SSR引物,对中国栽培的48个猕猴桃品种(品系)进行了遗传多样性研究,结果表明中国猕猴桃栽培品种具有较高的遗传多样性,SSR标记在猕猴桃品种中有较高鉴定效率;栗琪等(2004)对中华猕猴桃(A.chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)的9个天然居群的遗传多样性进行了初步分析,通过对14对猕猴桃引物的筛选,8对重现性好的引物扩增结果表现出良好的多态性。Liu等(2010)和刘亚令等(2006)对毛花猕猴桃自然居群进行了SSR分析,结果表明毛花猕猴桃自然居群的多态信息含量变化范围为0.705~0.827。然而,本研究中在对武功山境内的野生毛花猕猴桃SSR遗传多样性分析时,70份种质资源材料的多态信息含量变化范围为0.358~0.837。造成武功山境内自然居群遗传多样性含量变化范围不同的原因除了本身的群体结构差异之外,可能主要是由于随机选择SSR位点的所带来的影响(刘亚令等,2008)。虽然所收集的70份野生毛花猕猴桃种质资源为一个野生居群,各个单株都分布在很近的地域范围,同处在相同或相近的气候和地域环境条件下,野生毛花猕猴桃单株之间具有一定的亲缘关系,但各自遗传背景的却存在一定的多样性。因此,通过SSR分子标记分析野生毛花猕猴桃种质资源遗传多样性,可为野生毛花猕猴桃居群优良单株的选择在分子水平上提供了依据。野生毛花猕猴桃资源开发与利用工作重点是应该结合毛花猕猴桃具有高AsA含量的特性,发掘与其相关的SSR标记位点(汤佳乐等,2014),揭示野生毛花猕猴桃AsA富集的分子特征,并有效地促进改良猕猴桃果实品质性状与种质创新。3.3ssr聚类分析岁立云等(2013)在对中华猕猴桃和美味猕猴桃红肉类型猕猴桃调查研究中发现两种猕猴桃亲缘关系较近,有按地理来源优先聚类的趋势,且果实性状数据和AFLP数据之间具有极显著的相关性。本研究中通过对70份野生毛花猕猴桃种质资源基于遗传距离的聚类分析,GS值在0.65水平上将所有的材料划分成Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个组,说