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【合成】Nature Synthesis：浙大连佳长课题组工程改造毕赤酵母实现长春质碱的从头合成

花匠小妙招
2025-10-11 02:29

导读

浙江大学化学工程与生物工程学院连佳长研究员课题组在Nature Synthesis发表研究论文“Biosynthesis of Catharanthine in Engineered Pichia pastoris”，首次报道了利用毕赤酵母细胞工厂来高效合成长春质碱。研究团队利用表征的整合位点，以异胡豆苷和荆芥醇作为节点，将长春质碱合成途径分成三个功能模块，在毕赤酵母内分模块依次进行整合和优化，首次在毕赤酵母中实现了长春质碱的从头合成。构建的毕赤酵母工程菌株 CAN19在摇瓶和发酵罐上的产量分别为0.38 mg/L和2.57 mg/L。长春质碱途径是迄今为止在非模式菌株中构建的最为复杂的生物合成途径，证明了毕赤酵母作为合成植物天然产物细胞工厂的优势和巨大潜力。

Question 1

长春质碱是什么？作用是什么？

Answer

长春质碱是一种萜类吲哚生物碱，是一类具有重要价值的植物天然产物，主要作为一线抗癌药物长春碱的直接合成前体。长春碱是长春质碱和文多灵的异质二聚体，主要来源于长春花，目前为治疗癌症的最有效药物。由于其结构复杂，导致全化学合成难度大、成药收率低、生产成本高，因此工业上难以大规模制备长春碱。目前，长春碱主要通过植物萃取获得，但存在含量低（约占鲜重约0.0002%）、周期长、供应不稳定等问题。近年来随着长春质碱和文多灵生物合成途径的解析，以及合成生物学的发展，使得利用细胞工厂合成长春碱具备了可行性。

以毕赤酵母作为细胞工厂实现抗癌药物长春碱前体

——长春质碱的从头合成

Question 2

为什么选择毕赤酵母，毕赤酵母是如何改造的？

Answer

毕赤酵母是甲基营养型酵母，具有高效表达外源蛋白的能力，外源蛋白的表达量可达细胞总蛋白的30%。其拥有真核生物中最强的启动子pAOX1，可用于CYPs等限速酶的高水平表达，在植物天然产物的合成方面具备独特的优势，因此我们选择毕赤酵母作为合成长春质碱的宿主。

我们首先在毕赤酵母中建立了基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术体系，并表征了一系列高效的基因组整合位点，发现三位点同时整合的效率可达60%，这为我们在毕赤酵母中快速重构长春质碱合成途径奠定基础。

基于CRISPR/Cas9系统的毕赤酵母基因组编辑技术体系

Question 3

利用毕赤酵母细胞工厂来高效合成长春质碱的原理是什么？

Answer

经过科学家的不断努力，最近成功解析了长春质碱的生物合成途径，也就是鉴定了长春花中与长春质碱生物合成相关的全部基因。我们利用合成生物学方法，将长春花中的相关基因全部引入毕赤酵母基因组中，在毕赤酵母中重构长春质碱的生物合成途径。基于此，我们可以利用酵母发酵来替代长春花种植，有望建立低成本、可持续、供应可靠、环境友好的长春质碱新型获取方式。

Question 4

在本研究中，限制“毕赤酵母细胞合成长春质碱”发展的技术瓶颈是什么？研究团队是如何突这一瓶颈的？

Answer

第一个难点是毕赤酵母是作为非模式酵母，无法高效得进行基因编辑，引入外源基因。第二个难点是从植物到酵母，很多蛋白不能正确折叠，导致活性很低，甚至完全没有功能。第三个难点是途径非常的长，中间体无法有效检测，在整个实验过程中难以判断限速步骤。

针对这些难点，我们做了大量的尝试性和探索性的工作。首先，我们对毕赤酵母进行了改造，创建了能高效引入外源途径的毕赤酵母基因编辑体系。其次，我们对途径中的关键限速酶进行分子改造以提高活性。最后，我们对长春质碱合成途径进行了分模块构建与优化，突破了长春质碱的合成瓶颈，提高了长春质碱的产量。

在毕赤酵母中分模块构建及优化长春质碱从头合成途径

Question 5

研究过程中优化合成途径的难点是什么，如何解决？

Answer

在毕赤酵母细胞内重构长春质碱合成途径的最大难点是长春质碱中间体的检测。长春质碱合成途径中的中间体都是不稳定的化合物，这导致我们在构建途径的过程中无法有效的对其进行定性和定量。无法检测中间体导致我们无法确认途径中存在的限速步骤和歧化途径，影响了产物的合成和产量的提升。

我们通过基因敲除来构建中间体积累的菌株，利用超高效液相色谱串联质谱联用仪来对中间体进行定性和定量。我们通过增加基因拷贝数，比较目的产物的产量来鉴定限速步骤。

Question 6

本文作为首次报道“利用毕赤酵母细胞工厂来高效合成长春质碱”的文章，最大的创新点/优势在哪里？

Answer

创新点主要在于利用工程改造的毕赤酵母实现了复杂天然产物长春质碱的从头生物合成，表明毕赤酵母细胞工厂可利用简单碳源合成各类天然产物，也为长春碱的全合成奠定了基础。

Question 7

这一研究成果的前景应用如何？

Answer

首先，前期我们在毕赤酵母建立了基于CRISPR/Cas9技术的合成生物学工具，借助这一工具，我们只需一轮转化即可组装含有6个外源基因的合成途径，由此可以实现外源多基因合成途径的高效快速整合。这是首次在非模式酵母中实现萜类吲哚生物碱的全合成，预示着我们进一步在该细胞工厂内可实现文多灵、长春碱、长春新碱等多种植物天然产物的合成。同时该细胞工厂也可利用甲醇合成高附加值的产物，优化化石能源为主体的能源结构，缓解环境问题，实现碳资源的充分利用。

Question 8

请介绍一下你们的团队？

Answer

首先是我们的导师连佳长老师，不论是科研还是日常生活中，他都给予我们学生关心与帮助。科研工作中对我们严格要求并悉心、耐心指导，积极与我们交流，引导大家发现问题、思考问题、解决问题，最终取得进步。在日常生活中非常关心我们的身体健康，提醒我们劳逸结合。在疫情期间更是暖心的为我们准备了防疫物资和药物，让我们度过了那段艰难的时光。

我们的团队也是一个非常优秀的团队，对于研究的热爱让大家投入了自己全部的精力与时间，实验室从早到晚都能看到大家忙碌的身影，茶余饭后的时间里同学们也会相互讨论研究上的困惑，互相帮助对方解决疑难。

Question 9

关于科研有没有什么心得和大家分享？

Answer

做科研需要细心、耐心，多看文献、多和老师同学交流、多听一些相关领域的讲座。针对同一个问题，不同的人会有不同的解决思路，多交流才能开阔眼界。眼界开阔了，科研道路才能走的长久。在做科研的过程中，难免会遇到一些挫折和困难，不要被一时的困难影响心态，要从长久的角度来思考。短时间的成功和失败都是成长的积粮，只要好好吸收，认真探索，每一份付出都会给予回报。

文章链接 | https://www.nature.com/articles/s44160-022-00205-2

来源：浙大化工