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一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法.pdf

花匠小妙招
2024-10-10 22:15

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1、(10)授权公告号 CN 102071248 B (45)授权公告日 2013.02.27 CN 102071248 B *CN102071248B* (21)申请号 200910223808.5 (22)申请日 2009.11.23 C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人广西大学地址 530004 广西壮族自治区南宁市大学路 100 号 (72)发明人何勇强姜伯乐唐纪良岑卫健姜伟刘娇黄俊锭姜伯乐等 . 一个可用于鉴定野油菜黄单胞菌正向调控 hrpX 基因的报告质粒的构建 .广西农业生物科学 .2008, 第 27 卷 ( 第 1 期 ),19-24. 。

2、Xu R.Q. 等 .AvrAC(Xcc8004), a type effector with a leucine-rich repeat domain from Xanthomonas campestris pathovar campestris confers avirulence in vascular tissues of Arabidopsis thaliana ecotype Col-0.Journal of Bacteriology .2008, 第 190 卷 ( 第 1 期 ),343-355. 何晨阳等 . 植物过敏反应中的生理生化变化 .植物生理学通讯 .1996, 第。

3、 32 卷 ( 第 2 期 ),150-154. (54) 发明名称一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法 (57) 摘要本发明披露了一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法，包括：找出十字花科黑腐病菌 8004 菌株基因组中的无毒基因；用所述 8004 菌株基因组中的无毒基因构建系列的鉴别菌株；将至少带有所述无毒基因的农杆菌悬液注渗到十字花科应试寄主叶片脉间，并检测应试寄主的过敏反应。本发明不仅能够快速地鉴定出十字花科作物抗病品种，而且能提供十字花科作物抗病基因的相关信息，为快速分离、克隆抗病基因奠定了基础，这无疑对十字花科作物抗病育种以及提高十字花科类。

4、蔬菜的产量和品质具有显著的不可估量的意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员刘苗权利要求书 1 页说明书 5 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 5 页附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法，包括：找出十字花科黑腐病菌 8004 菌株基因组中的无毒基因，该无毒基因公布在 NCBI 的基因序列号为 XC_0542，基因标识 GeneID 为 3381550 ；用所述 8004 菌株基因组中的所述无毒基因构建系列的鉴别菌株；将带有所述无毒基因 XC_0542 。

5、的农杆菌悬液注渗到椰菜花应试寄主叶片脉间，并检测所述椰菜花应试寄主的过敏反应。 2. 按照权利要求 1 所述的鉴定方法，其特征在于，若在所述椰菜花应试寄主上检测到所述过敏反应，则表明所述椰菜花应试寄主对所述无毒基因发生了识别作用，提示所述椰菜花应试寄主具有针对该无毒基因的抗病基因。 3. 按照权利要求 1 或 2 所述的方法，其特征在于，所述找出十字花科黑腐病菌 8004 菌株基因组中的无毒基因，具体包括：在所述十字花科黑腐病菌 8004 菌株基因组中搜索已注释的无毒基因 XC_0542，并验证的新的无毒基因的编码区。 4. 按照权利要求 1 或 2 所述的方法，。

6、其特征在于，用所述 8004 菌株基因组中的所述无毒基因构建鉴别菌株，具体包括：克隆所述无毒基因 XC_0542 全长序列作为候选基因，并将所述候选基因克隆于表达双元载体 pBI121 中，构建含有所述无毒基因 XC_0542 的表达载体；通过农杆菌注渗法分别将含有所述无毒基因 XC_0542 的表达载体导入根癌农杆菌 EHA105 菌株中，构建所述系列的鉴别菌株。 5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，将带有所述无毒基因XC_0542的农杆菌悬液注渗到椰菜花应试寄主叶片脉间，具体包括：将包含无毒基因 XC_0542 的农杆菌在根癌农杆菌培养基 YEB 。

7、中，于 28培养 24 小时，离心收集菌体，再用无菌水稀释成 OD600 1.0 的菌体悬液；用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液约 10 微升，从所述椰菜花应试寄主的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的所述十字花科寄主置于 28及 80湿度的环境中，连续光照 16 小时及连续黑暗 8 小时，交替进行，共观察 48 小时。 6. 按照权利要求 5 所述的方法，其特征在于，检测所述椰菜花应试寄主的过敏反应，具体包括：在所述椰菜花应试寄主上以十字花科黑腐病菌野生型 Xcc 8004 作阳性对照，以含有所述 pBI121 的所述 EHA10。

8、5 菌株作阴性对照，观察若所述椰菜花应试寄主上产生含无毒基因 XC_0542 表达载体的鉴别菌株的过敏反应，则确认所述椰菜花应试寄主相对所述无毒基因 XC_0542 的抗病品种。权利要求书 CN 102071248 B 2 1/5 页 3 一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法技术领域 0001 本发明涉及作物抗病品种的鉴定方法，尤其涉及十字花科作物抗病品种的鉴定方法。背景技术 0002 十字花科蔬菜黑腐病的病原菌为十字花科黑腐病菌 (Xcc， Xanthomonascampestris pv.campestris)，也称野油菜。

9、黄单胞菌野油菜致病变种。十字花科蔬菜黑腐病主要发生在大白菜、萝卜、菜心、芥菜、绿菜花、白菜花、苤蓝及油菜等十字花科蔬菜作物上，近几年来发病有逐渐加重的趋势，降低了该类蔬菜的产量和品质，造成很大的经济损失。种植作物的抗病品种是对付作物病害的有效措施之一，而鉴定作物抗病品种资源则是抗病育种的基础。 0003 生物性病原最主要的是真菌，其次是病毒、细菌、线虫、类菌原体、放线菌以及寄生性种子植物等。这些病原生物多数为寄生性微生物，常统称为病原物；其中真菌和细菌性病原又称为病菌，被病原物寄生的植物称为寄主植物，简称寄主。 0004 病原菌群对寄主植物。

10、有致病性分化现象是指，同种病原物内的不同群体对不同分类单元的寄主植物的致病性不同。 0005 病原物的无毒基因是指病原物遗传因子，其编码的产物激发病原物与植物特异性相互作用。无毒基因是决定对寄主植物特异性不亲和的基因，农杆菌在植物体内瞬间表达无毒基因，可引起依赖于寄主抗病基因的过敏反应。寄主抗病基因是经典遗传学基因对基因 (gene-for-gene) 假说中所指的与病原物无毒基因相对应的存在于植物特定品种中且在植物生长的整个周期或其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特有的一类基因。 0006 十字花科黑腐病菌群对寄主植物有明显的致病性分化现象，其主要原因之一就是病菌。

11、不同菌株无毒基因的种类或组成的差异，以及对应的寄主抗病基因的变化。 0007 以往，鉴定作物抗病品种的方法是这样的：从寄主植物的破口处接种上病原物，对该该寄主植物经过一段时间进行观察，如果未产生相应的病害，则说明该寄主植物为抗病品种，反之，则说明该寄主植物为非抗病品种。这种方法的缺点是其需要花费的时间较长，已经不适应日益发展的农业现代化生产和建设的需要。 0008 参考文献 0009 1Keen NT.Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions.Annu RevGenet， 1990， 24 。

12、： 447-463. 0010 2Bai J， Choi S-H， Ponciano G， Leung H， and Leach JE.Xanthomonas oryzae pv.oryzaeavirulence genes contribute differently and specifically to pathogen aggressiveness.MolPlant-Microbe Interact.， 2000， 13 ： 1322-1329. 0011 3White FF.Prospects for understanding avirulence gene function.Cu。

13、rr. Opin.Plant Biol， 2000， 3 ： 291-298. 0012 4Heesemann， J.Algermissen， B.and Laufs， R.Genetically manipulated 说明书 CN 102071248 B 3 2/5 页 4 virulence of Yersiniaenterocolitica.Infect.Immun， 1984， 46 ： 105-110. 0013 5Dangle JL.The enigmatic avirulence genes of phytopathogenic bacteria.Curr TopMicro。

14、biol Immunol， 1994， 192 ： 99-118. 0014 6Vivian A and Gibbon MJ.Avirulence genes in plant-pathogenic bacteria ： signals orweapons.Microbiology， 1997， 143 ： 693-704. 0015 7Cornelis GR， Van Gijsegem F.Assembly and function of type III secretory systems.Annu.Rev.Microbiol， 2000， 54 ： 735-774. 0016 8Fens。

15、elau S， Balbo I， and Bonas U.Determinants of pathogenicity in Xanthomonascampestris pv.vesicatoria are related to proteins involved in secretion in bacterialpathogens of animals.Mol Plant-Microbe Interact， 1992， 5 ： 390-396. 0017 9Kim MG， Geng X， Lee SY， Mackev D.The Pseudomonas syringae type III ef。

16、fectorAvrRpml induces significant defenses by activating the Arabidopsis nucleotide-bindingleucine-rich repeat protein RPS2.Plant J， 2009， 57(4) ： 645-653. 发明内容 0018 本发明所要解决的技术问题是提供一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法，能够快速地鉴定出十字花科作物抗病品种。 0019 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种十字花科作物抗病品种的鉴定方法，包括： 0020 找出十字花科黑腐病菌 8004 菌株基因组中的无毒基因。

17、； 0021 用所述 8004 菌株基因组中的无毒基因构建系列的鉴别菌株； 0022 将至少带有所述无毒基因的农杆菌悬液注渗到十字花科应试寄主叶片脉间，并检测应试寄主的过敏反应。 0023 优选地， 0024 若在应试寄主上检测到过敏反应，则表明该应试寄主对无毒基因发生了识别作用，提示该寄主具有针对该无毒基因的抗病基因。 0025 优选地，找出十字花科黑腐病菌 8004 菌株基因组中的无毒基因，具体包括： 0026 在十字花科黑腐病菌 8004 菌株基因组中搜索已注释的无毒基因，并验证的新的无毒基因的编码区。 0027 优选地，用 8004 菌株基因组中的无毒基因构建。

18、鉴别菌株，具体包括： 0028 分别扩增所有找出的无毒基因全长序列作为候选基因，并将候选基因克隆于表达双元载体 pBI121 中，构建含有所述无毒基因的表达载体； 0029 通过农杆菌注渗法分别将含有所述无毒基因的表达载体导入根癌农杆菌 EHA105 菌株中，构建系列的鉴别菌株。 0030 优选地，将至少带有所述无毒基因的农杆菌悬液注渗到十字花科应试寄主叶片脉间，具体包括： 0031 分别将鉴别菌株在根癌农杆菌培养基YEB中，于28培养24小时，离心收集菌体，再用无菌水稀释成 OD600 1.0 的菌体悬液；说明书 CN 102071248 B 4 3/5 。

19、页 5 0032 用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液约 10 微升，从十字花科寄主的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的十字花科寄主置于 28及 80湿度的环境中，交替进行连续光照 16 小时及连续黑暗 8 小时，共观察 48 小时。 0033 优选地，检测应试寄主的过敏反应，具体包括： 0034 在十字花科寄主上以十字花科黑腐病菌野生型 Xcc 8004 作阳性对照，以含有 pBI121 的 EHA105 菌株作阴性对照，观察若十字花科寄主上产生含无毒基因表达载体的鉴别菌株的过敏反应，则确认十字花科寄主相对所述无毒基因的抗病品种。 0035 采。

20、用本发明的对十字花科作物抗病品种进行鉴定的方法，不仅能够快速地鉴定出十字花科作物抗病品种，而且能提供十字花科作物抗病基因的相关信息，为快速分离、克隆抗病基因奠定了基础，这无疑对十字花科作物抗病育种以及提高十字花科类蔬菜的产量和品质具有显著的不可估量的意义。附图说明 0036 图 1 为 PCR 克隆 XC_0542 基因的电泳图谱； 0037 图 2 为 pBI0542 表达载体的酶切电泳图谱； 0038 图 3 为 EHA105 中 pBI0542 的 PCR 验证电泳图谱； 0039 图 4 为 EHA105/pBI0542 菌株在椰菜花上的 HR 反应。具体实施。

21、方式 0040 本发明提供的十字花科作物抗病品种的鉴定方法基于农杆菌注渗法，其发明构思是，利用无毒基因可引起依赖于寄主抗病基因的过敏反应这一特性，通过找出十字花科黑腐病菌群无毒基因，检验出寄主植物抗病基因的存在，由此能够快速地鉴定出十字花科作物抗病品种。 0041 本发明完成 Xcc 8004 菌株全基因组测序后，在全基因组水平注释了 8 个无毒基因，并用实验证明了2个新的无毒基因，用这10个无毒基因构建了一系列鉴别菌株，通过农杆菌介导瞬时表达的方法快速鉴定抗性寄主。分别将候选基因全长片段克隆到双元载体 pBI121上，然后通过三亲接合法导入根癌农杆菌EHA105。

22、菌株中构建鉴别菌株。用无针头注射器分别将这些带有不同效应物基因或无毒基因的农杆菌悬液注渗到寄主叶片脉间，检测过敏反应。若能引起过敏反应，就表明应试寄主植物对这个无毒基因发生了识别作用，提示该寄主植物具有针对该无毒基因的抗病基因。 0042 其具体操作方法如下： 0043 (1) 在十字花科黑腐病菌 8004 菌株基因组中搜索已注释的无毒基因和验证的新的无毒基因的编码区； 0044 该 Xcc 8004 菌株全基因组信息 (NC_007086.1) 已公布在 NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)的GenBank。

23、数据库中(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ Genbank/index.html)，这些无毒基因的基因序号和 GenBank 的 GeneID 号分别为： 0045 XC_0052(GeneID ： 3382689)， XC_0542(GeneID ： 3381550)， XC_1553(GeneID ： 3380160)， XC_1716(GeneID ： 3380265)， XC_2004(GeneID ： 3380545)， XC_2602(GeneID ： 3381136)， XC_2081(GeneID ： 3380621)， XC_2082(GeneID 。

24、： 3380622)， XC_3802(GeneID ：说明书 CN 102071248 B 5 4/5 页 6 3379421)， XC_4318(GeneID ： 3379936)。 0046 (2) 采用 PCR 方法，分别扩增上述无毒基因，并克隆于表达载体 pBI121 中，构建含有无毒基因的表达载体； 0047 (3) 分别将含有无毒基因的表达载体导入根癌农杆菌中，构建鉴别菌株； 0048 (4) 分别将鉴别菌株在根癌农杆菌培养基 YEB 中，于 28培养 24 小时，离心收集菌体，再用无菌水稀释成 OD600 1.0 的菌体悬液； 0049 (5) 用。

25、无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液约 10 微升，从十字花科植物的叶背注渗入叶脉间；接种后的植物在 28， 80湿度的环境中，交替进行连续光照 16h 及连续黑暗 8h，共观察 48 小时； 0050 若引起了过敏反应 ( 如图 4A-2 所示 )，就表明应试寄主植物对这个无毒基因发生了识别作用，提示该寄主植物具有针对该无毒基因的抗病基因。 0051 下面以无毒基因中之一 XC_0542 基因 (GeneID ： 3381550) 为例，进行更详细地说明。 0052 实施例 1 0053 XC_0542 基因的克隆并构建表达载体 pBI0542 0054 根据 XC。

26、_0542 的基因序列，设计引物： 0055 正向引物： F， 5 -GGGTCTAGAATGGAGATCAAGAAAGCGCAGTCC-3， 0056 反向引物： R， 5 -GGGGGATCCTCAGCCGGAGCGCGGCGGGTC-3。 0057 以十字花科黑腐病菌总 DNA 为模板， PCR 扩增该基因全长序列，并将其克隆至 pBI121 中，构建表达载体 pBI0542 并酶切验证，请参见图 1。序列被亚克隆于 pK18mob 中，并进行了测序验证，该序列与 XC_0542 基因 (GeneID ： 3381550) 序列一致。 0058 图 1 为 PCR 克隆。

27、 XC_0542 基因的电泳图谱， M ： 0321 标准 DNA( 片段大小从大到小依次为： 3kb， 2kb， 1.5kb， 1.2kb， 1.0kb， 0.9kb， 0.8kb， 0.7kb， 0.6kb， 0.5kb， 0.4kb， 0.3kb， 0.2kb， 0.1kb， ) ；泳道 1 ： PCR 克隆 XC_0542 基因的片段。 0059 实施例 2、将表达载体 pBI0542 导入农杆菌 0060 将 pBI0542 三亲导入根癌农杆菌 EHA105 中，将得到的三亲接合子命名为 EHA105/ pBI0542，三亲接合子 PCR 验证，请参见图 2 和图。

28、3。 0061 图 2 为 pBI0542 表达载体的酶切电泳图谱， M ： 0321 标准 DNA( 片段大小从大到小依次为： 3kb， 2kb， 1.5kb， 1.2kb， 1.0kb， 0.9kb， 0.8kb， 0.7kb， 0.6kb， 0.5kb， 0.4kb， 0.3kb， 0.2kb， 0.1kb， ) ；泳道 1 ：基因克隆 pBI0542 用 XbaI/BamHI 的酶切片段。 0062 图3为EHA105中pBI0542的PCR验证电泳图谱， M ： 0321标准DNA(片段大小从大到小依次为： 3kb， 2kb， 1.5kb， 1.2kb， 1.0kb，。

29、 0.9kb， 0.8kb， 0.7kb， 0.6kb， 0.5kb， 0.4kb， 0.3kb， 0.2kb， 0.1kb， ) ；泳道 1 ： EHA105 中 pBI0542 的 PCR 验证片段。 0063 实施例 3 0064 农杆菌过敏反应 (HR) 试验 0065 所用的植物材料为椰菜花， A 为抗病品种， B 为感病品种。选取健康的椰菜花全展叶片供试。 0066 (1) 接种农杆菌至加有相应抗生素的 LB 培养基 28过夜培养。 0067 (2)OD600为 0.4 0.5 时收集 1mL 的菌液于 1.5mL 的 EP 管， 5000rpm 离心 5min，倒说明。

30、书 CN 102071248 B 6 5/5 页 7 掉上清液，用 2mL 诱导培养基 (10mM MgCl2， 5mM MESpH5.6， 150M AS) 重悬， 28诱导培养 5h。 0068 (3) 用诱导培养基调 OD600至 0.4 0.5，以十字花科黑腐病菌野生型 Xcc 8004 作阳性对照 ( 如图 4 中 A1 和 B1)， EHA105/pBI121 作阴性对照 ( 如图 4 中 A3 和 B3)。用无针头的针筒吸取菌液注渗到辣椒苗叶片背面的叶肉中，形成一个可见的浸润斑。 0069 (4)将椰菜花放在28， 80湿度的环境中，连续光照16h黑暗8h，交替进行。

31、，连续观察 48 小时。 0070 EHA105/pBI0542 农杆菌过敏反应试验请参见图 4A-2，是快速坏死斑，但病斑不扩展，表明 XC_0542 基因在椰菜花 A 上能引起过敏反应，初步确认椰菜花 A 相对无毒基因 XC_0542的抗病品种。图4A-1是Xcc 8004引起的HR反应，菌体同样不能在椰菜花A叶内扩展；图 4B-1 结果表明 Xcc 8004 能在椰菜花 B 叶内扩展；图 4B-2 结果表明 EHA105/pBI0542 农杆菌不能引起椰菜花 B 产生 HR 反应。 0071 图4为EHA105/pBI0542菌株在椰菜花上的过敏HR反应，图中： A抗病品种； B感病品种。1 为 Xcc 8004 阳性对照， 2 为 EHA105/pBI0542( 意为含有 pBI0542 的 EHA105 菌株 ) HR 反应， 3 为 EHA105/pBI121( 意为含有 pBI121 的 EHA105 菌株 ) 阴性对照， 4 为无菌水。说明书 CN 102071248 B 7 1/2 页 8 图 1图 2 图 3 说明书附图 CN 102071248 B 8 2/2 页 9 图 4 说明书附图 CN 102071248 B 9 。