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基于代谢组学的灯盏花素抗阿霉素心脏毒性作用机制研究

花匠小妙招
2025-11-19 21:35

20 世纪50 年代起，蒽环类化疗药物阿霉素广泛应用于乳腺癌、淋巴瘤等实体瘤以及多种血液肿瘤的临床治疗[1-2]，随着其临床使用增多，其不良反应如心脏毒性、高血压及心律失常等常见的心血管疾病损害也日益突出[3]，制约其进一步发展和应用。研究显示，蒽环类化疗药物是导致心脏毒性的首要因素，肿瘤患者因药物相关心脏毒性导致的死亡风险已超过了肿瘤自身或因复发而导致的死亡风险[4-7]。右雷佐生是临床指南推荐的作为预防蒽环类化疗药物心脏毒性的唯一有效药物，近20 年来一直用于防止蒽环类抗肿瘤药物产生的心脏毒性[8]，然而右雷佐生会增加霍奇金淋巴瘤儿童经前综合症、骨髓抑制等[9-10]，不良反应显著。因此为进一步提高蒽环类化疗药物临床发展，急需开发新型安全高效的心脏毒性保护剂。

灯盏花素是灯盏花中几种黄酮类化合物的粗提物，具有抗氧化、抗炎、清除自由基等生物活性[11]，主要用于治疗高血压、脑栓塞和脑血管意外引起的瘫痪等疾病[12-13]。研究表明，灯盏花素可用于治疗脑梗死和糖尿病肾病，具有明显的神经改善和保护作用[14-17]。然而其对化疗药物导致的心脏损伤有无保护价值，迄今为止并未发现相关报道。本研究利用超高效液相色谱- 四极杆- 飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS ）技术，探究灯盏花素对阿霉素诱导的具有心脏毒性的小鼠血浆代谢物的变化趋势及其相关代谢通路，通过代谢组学阐明灯盏花素治疗阿霉素诱导的心脏毒性的潜在生物标志物和可能机制。

1材料

1.1动物

1.2细胞

1.3药品与试剂

1.4仪器

Q Exactive™ HF 质谱仪、Vanquish UHPLC 色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；低温离心机（美国Scilogex 公司）；VICTOR Nivo 酶标仪（美国PerkinElmer 公司）；Cyto FLEX 流式细胞仪（美国Beckman 公司）；DM IL LED 倒置荧光显微镜（德国Leica 公司）。

2 方法

2.1 动物造模、分组及给药

小鼠随机分为对照组、模型组、右雷佐生（12 mg/kg ）[18]组和灯盏花素低、中、高剂量（4 、8 、16 mg/kg ）[19]组，每组8 只。除对照组外，其余各组小鼠每7 天ip 阿霉素（4 mg/kg ），持续3 周，累积剂量为12 mg/kg [20]；造模同时各给药组ip 相应药物，1 次/d ，连续3 周。对照组不做任何处理，每天监测各组小鼠存活率并记录体质量变化。

2.2 血浆NT-proBNP水平的测定

小鼠麻醉后采血，收集血液，离心取上清，按照ELISA 试剂盒说明书测定血浆NT-proBNP 水平。

2.3心脏组织病理变化

给药结束后，麻醉小鼠，以0.9% 氯化钠溶液进行心脏灌注后，断头处死取心脏。将心脏组织置于4% 多聚甲醛中固定，经切片、二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水、苏木素染色、清洗、伊红染色、乙醇梯度脱水、封片，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.4组织代谢研究

2.4.1样本代谢物提取取100 μL 血样置于EP 管中，加入400 μL 80% 甲醇水溶液，涡旋振荡，冰浴静置5 min ，4 ℃、15 000 ×g 离心20 min ；取一定量的上清液加质谱级水稀释至甲醇含量为53% ，4 ℃、15 000 ×g 离心20 min ，收集上清，LC-MS 进样分析。

2.4.2UHPLC-MS分析C 18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），流动相为含0.1%甲酸的乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～1.5 min，2% B；1.5～12.0 min，2%～100% B；12.0～14.0 min，100% B；14.0～14.1 min，100%～2% B；14.1～17.0 min，2% B；柱温40 ℃；体积流量0.2 mL/min；进样量4 μL；在分析过程中，所有样品于4 ℃保存。在质谱仪上用电喷雾进行质谱分析，m/ z 设定为100～1500；分辨率设置为30 000的全扫描模式；干燥气为氮气；电喷雾毛细管电压3.2 kV；气体温度为320 ℃。

2.4.3数据预处理和代谢物鉴定将下机数据文件导入CD 3.1 搜库软件中进行处理，对每个代谢物进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后设置相应参数等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与数据库进行比对，去除背景离子，并对原始定量结果进行标准化处理，最后得到代谢物的鉴定和相对定量结果。

2.4.4差异代谢物的筛选使用京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes ，KEGG ）数据库（https://www.genome.jp/ kegg/pathway.html ）、HMDB 数据库（https:// hmdb.ca/metabolites ）和LIPID Maps 数据（http:// www.lipidmaps.org/ ）对鉴定到的代谢物进行注释。使用代谢组学数据处理软件对数据进行转换，然后进行主成分分析（principal component analysis ，PCA ）和偏最小二乘法判别分析（partial least square-discriminant analysis ，PLS-DA ），进而得到每个代谢物的变量投影重要性（variable importanceplot ，VIP ）值。基于t 检验来计算各代谢物在两组间统计学显著性（P 值），并计算代谢物在两组间的差异倍数即FC 值。差异代谢物筛选的默认标准为VIP ＞1 、P ＜0.05 且FC ≥2 或FC ≤0.5 。对筛选到的差异代谢物进行层次聚类分析，将具有相同特征的代谢物归为一类，并发现代谢物在实验组间的变化特征，结果以热图进行展示。

2.4.5差异表达代谢物的代谢通路分析KEGG 数据库搜索差异表达代谢物的相关代谢通路。

2.5体外实验

2.5.1细胞培养H9c2细胞用含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 链霉素的DMEM 培养基，于37 ℃、5% CO 2培养箱中培养。待细胞融合度达到80% 以上时进行传代，取处于对数生长期、生长状态良好的细胞进行实验。

2.5.2 CCK-8 法测定灯盏花素最佳浓度取处于对数生长期的H9c2 细胞，胰酶消化后以1 ×10 4/ 孔接种于96 孔板中，设置对照组、阿霉素组、右雷佐生（20 μmol/L ）[21]组和不同浓度（10 、20、50、100、200 μmol/L）的灯盏花素[22]组。对照组仅加入DMEM培养基，其余各组加入阿霉素（5 μmol/L）[23]，各给药组再加入相应药物，处理24 h 。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育0.5 ～4 h 后，采用酶标仪测定450 nm 处的吸光度（A ）值。

2.5.3GSH 和MDA 含量检测取处于对数生长期的H9c2 细胞，胰酶消化后以1 ×10 4 / 孔接种于6 孔板中，对照组仅加入DMEM 培养基，其余各组细胞分别加入阿霉素（5 μmol/L ）、右雷佐生（20 μmol/L ）、阿霉素（5 μmol/L ）＋右雷佐生（20 μmol/L ）、灯盏花素（200 μmol/L ）、阿霉素（5 μmol/L ）＋灯盏花素（200 μmol/L ），处理24 h ，按照试剂盒说明书测定测定GSH 、MDA 含量。

2.5.4 细胞ROS 水平测定按“2.5.3 ”项下方法分组及给药，收集细胞，用PBS 洗涤，加入DCFH-DA 探针（10 μmol/L ）孵育30 min ，弃上清，用PBS 洗涤2 次，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.5.5 Annexin V-FITC/PI 测定细胞凋亡按“2.5.3 ”项下方法分组及给药，收集细胞，用无EDTA 的胰酶消化收集到15 mL 离心管中，室温孵育5 min ；加入DPBS ，离心弃上清，加入染色液重悬细胞，孵育后采用流式细胞仪采集细胞。

2.5.6 TUNEL 染色分析细胞凋亡情况按“2.5.3 ”项下方法分组及给药，收集细胞，用4% 多聚甲醛固定15 min ，然后用0.2% Triton X-100 固定5 min ，用100 μL 平衡缓冲液平衡，除去缓冲液，用50 μL 末端脱氧核苷酸转移酶反应混合物处理细胞，37 ℃孵育60 min ，用2 ×SSC 缓冲液冲洗2 次细胞，然后通过Green 226 荧光染色检测TUNEL 阳性细胞，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.5.7 Western blotting 法检测细胞Nrf2 、AMPK 和RhoA 蛋白表达情况取处于对数生长期的H9c2 细胞，胰酶消化后以1 ×10 4 / 孔接种于6 孔板中，对照组仅加入DMEM 培养基，其余各组细胞分别加入阿霉素（5 μmol/L）、灯盏花素（200 μmol/L）、阿霉素（5 μmol/L）＋灯盏花素（200 μmol/L），处理24 h ，收集细胞，加入RIPA 细胞裂解缓冲液，于冰上裂解，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min ，取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，将等量的蛋白与5×Loading Buffer混合，100℃煮沸5 min 。蛋白样品经十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，加入5% 脱脂牛奶，室温封闭，分别加入Nrf2 、AMPK 、RhoA 和GAPDH 抗体，4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜后，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体，室温孵育，使用BioRad 凝胶doc 系统曝光显影，采用Image J 软件进行定量分析。

2.5.8 统计分析使用IBM SPSS Statistics 25 软件对数据进行分析，数据以表示。多组间均数比较采用单因素方差分析。

3结果

3.1 灯盏花素可减轻阿霉素引起的心脏功能障碍和心肌形态变化

如图1-A 所示，与对照组相比，模型组小鼠血浆心脏毒性标志物NT-proBNP 水平显著升高（P ＜0.05 ）；与模型组比较，各给药组小鼠血浆NT-proBNP 水平均显著降低（P ＜0.05 ）。如图1-B 所示，对照组小鼠心肌组织结构正常，与对照组相比，模型组小鼠心肌组织产生损伤性形态学改变包括心肌萎缩、间隙增大、变性坏死、水肿、炎性浸润，各给药组以上变化减轻。

3.2阿霉素诱导的心肌细胞的代谢紊乱

血浆的代谢组学可以在一定程度上反映药物干预对心脏功能的影响。通过PCA 分析了对照组、模型组、右雷佐生组和灯盏花素低、中、高剂量组总离子模式下的PCA 图，用来评估各组代谢物之间的分布和差异。如图2 所示，PCA 图表明所有样本都在置信区域内，不同组别之间存在较明显的差异，同时可能由于不同小鼠生活习惯及对药物适应性差异，同组内样本之间的分布呈现一定分散。在对照组和模型组的代谢物之间观察到明显的分离，表明由于ip 阿霉素引起小鼠代谢情况改变，造成小鼠血浆中的内源性物质水平受到干扰。各给药组均向对照组前移，表明灯盏花素和右雷佐生缓解了阿霉素诱导的心脏中毒小鼠的代谢紊乱，恢复了小鼠的内源性物质水平。但具体的差异情况还需要使用PLS-DA 来研究对照组和模型组、模型组和灯盏花素组间的差异，以寻找治疗心脏中毒的潜在生物标志物。

3.3 阿霉素心脏毒性的潜在生物标志物

为了研究给予不同剂量灯盏花素后对小鼠内源性物质代谢影响的大小，采用PLS-DA 法分析了组间差异。根据VIP ≥1 、P ＜0.05 标准，将组间有显著差异的候选物确定为代谢的候选生物标志物，评估灯盏花素治疗阿霉素诱导心脏毒性的潜在机制和可能的代谢物的变化。

如表1 所示，在各组中找到DL - 精氨酸（DL -arginine ）、L - 苏氨酸（L -threonine ）、缬氨酸（valine ）、丝氨酸（L -serine ）、肌酸（creatine ）、牛磺酸（taurine ）、前列腺素（prostaglandin ）、磷脂酰胆碱（PC ）、溶血磷脂酰肌醇（LPI ）等16 个代谢物可以作为灯盏花素干预后的生物标志物，其中DL - 精氨酸、L - 苏氨酸、缬氨酸、丝氨酸等水平降低，前列腺素水平显著升高，不同剂量灯盏花素干预后，含量异常的代谢物均有不同程度的回调，这些生物标志物在灯盏花素的作用下含量都有显著变化（图3 ），它们在机体氨基酸代谢、脂质代谢及炎症水平调节中发挥重要作用[24-28]。此外还构建了基于代谢物的聚类热图（图4 ），以确定分布情况并找出组间差异。以上结果表明在不同剂量灯盏花素的干预下，模型组小鼠血浆代谢物的含量产生了显著变化。

3.4 差异代谢物的相关通路

3.5 灯盏花素减弱阿霉素诱导的H9c2细胞毒性

如图6-A 所示，与阿霉素组相比，10 ～200 μmol/L 灯盏花素显著升高细胞存活率（P ＜0.05 ）。

3.6 灯盏花素改善阿霉素诱导的H9c2细胞氧化应激及细胞凋亡

研究表明，阿霉素能够诱导心脏毒性和氧化应激，产生的过量ROS 可能会破坏DNA 、蛋白质和膜结构的不饱和脂质等成分，最终加速细胞凋亡或诱发脂质过氧化引起细胞铁死亡，从而导致心脏毒性[29]。如图6-B ～D 所示，阿霉素处理的H9c2 细胞中MDA 、ROS 水平显著升高（P ＜0.05 ），GSH 水平显著降低（P ＜0.05 ）；灯盏花素明显降低阿霉素诱导的H9c2 细胞中MDA 和ROS 水平（P ＜0.05 ），显著升高GSH 水平（P ＜0.05 ）。

细胞凋亡是阿霉素诱导心脏毒性的重要表现。如图7-A 所示，与对照组相比，阿霉素处理后细胞凋亡和坏死比重明显升高，活细胞数量显著减少，经灯盏花素和右雷佐生处理后凋亡细胞数量显著减少。如图7-B 所示，H9c2 心肌细胞长期暴露于阿霉素下导致DNA 片段化增加，与对照组相比，TUNEL 阳性细胞数显著增加（P ＜0.05 ），用灯盏花素处理后TUNEL 阳性细胞数量显著减少（P ＜0.05 ），表明灯盏花素有效改善阿霉素诱导的DNA 断裂。

3.7 灯盏花素调控阿霉素诱导的H9c2细胞Nrf2、RhoA 和AMPK蛋白表达

阿霉素诱导心脏毒性不仅增加细胞凋亡，而且影响凋亡相关蛋白的表达[30-34]。如图8 所示，与对照组比较，阿霉素组H9c2 细胞AMPK 蛋白表达水平显著升高（P ＜0.05 ），Nrf2 和RhoA 蛋白表达水平均显著降低（P ＜0.05 ）；与阿霉素组比较，灯盏花素组和灯盏花＋阿霉素组H9c2 细胞AMPK 蛋白表达水平显著降低（P ＜0.05 ），Nrf2 和RhoA 蛋白表达水平均显著升高（P ＜0.05 ）。

4 讨论

灯盏花素临床常用于治疗心脑血管等疾病，然而其介导的心脏保护所依赖的代谢调节机制尚不明确。为了进一步探究灯盏花素治疗阿霉素诱导心脏毒性的作用机制，研究了小鼠血浆代谢物和代谢途径的相关情况，结果显示灯盏花素治疗阿霉素心脏毒性与脂质代谢、氨基酸代谢和炎症水平调节密切相关。作为灯盏花素心脏保护形成的核心环节，神经活性配体受体相互作用是灯盏花素富集的主要通路。结合本研究结果，推测灯盏花素可能通过调节氨基酸代谢、脂质代谢和炎症水平来抑制细胞凋亡，通过神经活性配体- 受体通路保护受损心脏功能，最终抑制阿霉素产生的心脏毒性。

本研究结果显示，阿霉素诱导的心脏毒性与铁死亡，甘氨酸、丝氨酸及苏氨酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成等有关，这些代谢途径与细胞凋亡的发生密切相关，进一步在体外实验中重复验证了阿霉素诱导的细胞凋亡水平升高。铁死亡是一种由细胞内磷脂过氧化引发的细胞死亡类型，与细胞的铁含量、氨基酸代谢以及氧化还原状态密切相关，会催化细胞膜上不饱和脂肪酸的高表达，诱发脂质过氧化，从而导致细胞凋亡[35-37]。甘氨酸、丝氨酸及苏氨酸代谢途径的异常变化会影响免疫系统和其他器官功能的正常发挥，氨基酸为构建细胞质量提供底物，其异常会减少细胞增殖和迁移，导致细胞凋亡[38-39]。不饱和脂肪酸的生物合成涉及脂质含量较高的中枢神经系统，与许多心血管疾病的发生有关[29]，脂质代谢参与多种细胞信号通路，是维持细胞结构和提供能量的基本成分，但其异常变化可导致细胞功能障碍和坏死，从而引起细胞凋亡[40]，脂质代谢异常会影响AMPK 信号通路和神经活性配体受体相互作用通路。神经活性配体受体相互作用是灯盏花素发挥心脏保护作用的核心途径，调节神经活性配体受体的相互作用可以缓解心脏功能受损[41]。AMPK 是调节脂质代谢和细胞凋亡连接器上的关键蛋白，抑制AMPK 信号可以显著减弱阿霉素参与的脂质代谢异常，从而减少细胞凋亡和铁死亡，抑制细胞毒性[42-43]。丝氨酸和苏氨酸是RhoA 家族的下游介质，RhoA 蛋白可以通过三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate ，GTP ）依赖的方式激活丝氨酸和苏氨酸，2 个氨基酸的C 末端可能是Rho 家族潜在的药物靶点，丝氨酸和苏氨酸含量异常，会诱发RhoA 蛋白表达异常，引发细胞凋亡[44-45]，此外，Rho 家族相关蛋白表达异常会激活AMPK ，继而加重细胞凋亡[46]。Nrf2蛋白所在通路激活后会有效抑制炎症反应，减少炎症介质释放，降低细胞凋亡率[47-48]。阿霉素处理后的细胞AMPK 蛋白表达水平显著增加，严重干扰机体正常的脂质代谢，而Nrf2 和RhoA 蛋白表达水平显著降低，使氨基酸代谢异常，炎症水平升高，细胞凋亡增加。因此推测灯盏花素可能通过调节异常的氨基酸代谢、脂质代谢和炎症水平来抑制细胞凋亡，通过神经活性配体- 受体通路保护受损心脏功能，最终抑制阿霉素产生的心脏毒性。

本研究采用右雷佐生作为阳性对照药物，以确证灯盏花素对于阿霉素造成心脏损伤的治疗效果。右雷佐生可以通过减少炎症和细胞凋亡增加心肌细胞活力，从而减轻阿霉素心脏毒性[19]，而灯盏花素主要通过减弱细胞氧化应激和细胞凋亡减轻阿霉素心脏毒性。从代谢角度出发，不同于右雷佐生发挥心脏保护的主要代谢途径与能量代谢、氧化还原维持、磷脂和蛋白质代谢有关[50-52]，灯盏花素的保护作用更偏向于稳定氨基酸代谢、脂质代谢及炎症代谢，并且通过神经活性配体受体作用途径来保护心脏功能等。但灯盏花素通过抑制细胞凋亡来减轻阿霉素产生心脏毒性的具体通路有待进一步研究。

综上所述，本研究发现灯盏花素可以改善阿霉素诱导的心脏毒性，可能是通过调节脂质代谢、氨基酸代谢、炎症水平和神经活性配体受体相互作用等途径抑制阿霉素产生的细胞凋亡和心脏损伤。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）