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分子标记在植物学研究中的应用.docx

花匠小妙招
2024-10-23 16:46

分子标记在植物学研究中的应用 1 什么是分子标记随着近年来药理学的发展，遗传标记的类型不断扩大，不仅限于传统的形态标记。分子标记尤其具有独特的优越性，在植物学研究的各个领域得到了广泛应用。那么什么叫标记呢?King和Stansfield将其定义为代表一个位于染色体上已知位点的基因或一种清晰的表型性状。总的来说,分子标记目前主要应用于两方面:一是作为基因,尤其是一些重要农艺性状基因如抗虫、抗病基因或数量性状基因的检测尺度,要做到这点,首先必须确定与目的基因紧密连锁的分子标记;二是作为种群分析、种质资源分析及遗传育种的研究依据。 2 分子标记的类型和特征 2.1 同工酶标记的应用同工酶标记是60年代出现并应用于植物学研究中的分子标记。许多研究表明,植物中有些酶常以多种形式存在,这反应了植物组织发育的特异性及编码这些酶的等位基因之间的差异。当在适当的条件下电泳时,单个氨基酸的改变便可在其电泳的迁移率上显示出来,从而表现出同工酶的多态性。由于同工酶标记是共显性的,可直接检测杂合子,因此不仅是一种有效的“杂交测试剂”,可在早期识别并淘汰自花授粉得到的植株,还可直接反映基因表达水平上的差异。Gepts等用同工酶标记显示了种子贮藏蛋白的多样性。同工酶标记还被广泛用于建立遗传图谱、种群分析等研究中。然而其数量却非常有限,如在大豆中,只有19个同工酶标记被报道。加之它是结构基因的表达产物,只代表植物基因组的一小部分;同时极易受环境等因素的影响,这些都限制了它的应用。 2.2 rapd标记pcr扩增 Williams等应用短的“DNA寡核苷酸”(通常10 bp)作引物,通过PCR扩增来检测DNA的多样性。在PCR反应中,随机引物在模板链的不同位置与基因组DNA结合,而结合位点会因基因组DNA序列的改变而不同,经过数次PCR循环,而得到不同大小的DNA扩增带。这种技术的自动化程度很高,操作简单,可为遗传图谱的建立提供大量的RAPD标记。同时它不受时间、地点、环境等因素的干扰,因而被广泛应用于基因定位、物种多样性等研究中。但由于PCR对反应条件敏感,因此实验的重复性常成为困扰人们的问题。加之RAPD标记大多数为显性,无法准确区别纯合子与杂合子,为了克服这一缺点,目前已发展了一些相关的技术,如序列特异性扩增区(sequence characterized amplified region,SCAR) 、扩增片段长度多态性(amplification fragment length polymorphism, AFLP)及酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequences,CAPs)。这些技术克服了RAPD标记只作为显性标记的缺点,可提供更多的共显性标记。 2.3 人类基因组rflp-l-pcr检测dna片段大小的各特征融合在遗传图谱分析中的应用基因组DNA在经特定的内切酶消化后,产生大小不同的DNA片段,通过Southern印迹和与特定序列的探针杂交后,显示出DNA分子水平上的差异。基因组序列的改变引起内切酶酶切位点的缺失或插入,从而造成酶切后DNA片段大小的多态性。第1例将此技术应用于遗传图谱研究中的是冷泉港实验室对腺病毒血清型温敏突变基因遗传图谱的确定。此后第1张人类基因组RFLP图谱于1987年首次发表。近年来,这一技术也越来越多地应用于植物中。由于它不像同工酶标记那样数量有限,又是共显性的;不受环境、组织特异性等因素的干扰,从而能有效地在此基础上建立高密度的遗传图谱,并为研究重要性状基因、物种多样性等提供稳定的、分子水平上的标记。但其操作复杂,耗时耗钱,仅探针就至少有三种来源:cDNA克隆、植物基因组克隆、PCR克隆,而有效探针也有限,这都影响该标记的应用。 2.4 ssr标记的来源 SSR也被称为微卫星(microsatellite)。70年代初,人们便发现真核生物基因组中普遍存在着简单的重复序列,它们常连续重复多次,而且不同物种其重复序列及重复单位数都不同。如在大豆中便富含AT,ATT重复序列。这种简单重复序列是11~60 bp或2~5 bp为单位的重复序列。而在重复序列的两端往往是趋于保守的限制性内切酶的酶切位点。因此人们便在重复序列的两端设计特殊的引物,经PCR扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影,得到因简单重复序列重复单位数不同而引起的扩增片段的多态性。由于植物基因组中50%~80%为重复序列,因此用这一标记建立遗传连锁图也极其有效。Zhao证实在水稻中存在(GGC)n的SSR标记。然而,SSR与RFLP技术类似,操作复杂,劳动量大,首先需建立基因组文库以筛选合适的SSR,这些都是该技术目前在应用上的局限。 2.5 在遗传标记中的应用 90年代初,随着人类基因组研究计划的深入