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玉米分子标记及其在检测玉米开花期相关性状中的应用.pdf

花匠小妙招
2024-10-23 16:46

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711069055.8 (22)申请日 2017.11.03 (71)申请人中国农业大学地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号 (72)发明人田丰黄成 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称玉米分子标记及其在检测玉米开花期相关性状中的应用 (57)摘要本发明公开了玉米分子标记及其在检测玉米开。

2、花期相关性状中的应用。本发明公开的玉米分子标记为下述A1)或A2)或A3)： A1)序列表中序列1的第42-401位所示的DNA片段； A2)将A1)的 DNA片段经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)限定的核苷酸序列具有90或90以上同一性的DNA片段； A3)包含 A1)或A2)的DNA片段。实验证明，两条染色体均含有序列表中序列1的第42-401位所示的DNA片段的玉米的开花期、株高和叶片数显著少于两条染色体均不含有序列表中序列1的第42-401位所示的DNA片段的玉米，表明，本发明的玉米分子标记可用来鉴定玉米开花期、株高和叶片数。。

3、权利要求书2页说明书8页序列表1页附图1页 CN 107586881 A 2018.01.16 CN 107586881 A 1.玉米分子标记在检测或辅助检测玉米开花期相关性状中的应用；所述玉米分子标记为下述A1)或A2)或A3)： A1)序列表中序列1的第42-401位所示的DNA片段； A2)将A1)的DNA片段经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1) 限定的核苷酸序列具有90或90以上同一性的DNA片段； A3)包含A1)或A2)的DNA片段。 2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于： A3)为序列表中序列1或序列2所示的DNA片段。 3.检测玉米基因型。

4、的方法，所述基因型为AA基因型、 AB基因型和BB基因型；所述方法包括如下或：、检测待测玉米基因组DNA中对应于序列表中序列1的第42-401位的序列，如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测玉米为AA基因型；如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测玉米为BB基因型；如所述待测玉米基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测玉米为AB基因型； g1)含有序列表中序列1的第42-401位； g2)不含有序列表中序列1的第42-401位；、检测待测玉米基因组DNA中对应于序列。

5、表中序列1的DNA片段，如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述h1)的染色体，所述待测玉米为AA基因型；如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述h2)的染色体，所述待测玉米为BB基因型；如所述待测玉米基因组中两条染色体中一条为下述h1)的染色体，另一条为下述h2)的染色体，所述待测玉米为AB基因型； h1)对应于序列表中序列1的序列为序列1； h2)对应于序列表中序列1的序列为序列2。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：中所述检测待测玉米基因组DNA中对应于序列表中序列1的DNA片段通过引物对M1对所述待测玉米的基因组DNA进行PCR扩增进行；所述M1由。

6、序列表中序列1的第1-19位所示的单链DNA和与序列表中序列1的第482-501位互补的单链DNA组成。 5.检测玉米开花期相关性状的方法，所述开花期相关性状为开花期、株高或叶片数，所述方法包括下述X1)、 X2或X3)： X1)利用权利要求3或4所述的方法检测待测玉米的基因型， AA基因型的待测玉米的开花期短于或候选短于BB基因型的待测玉米； AA基因型的待测玉米的开花期短于或候选短于 AB基因型的待测玉米； AB基因型的待测玉米的开花期短于或候选短于BB基因型的待测玉米； X2)利用权利要求3或4所述的方法检测待测玉米的基因型， AA基因型的待测玉米的株高低于或候选低于BB。

7、基因型的待测玉米； AA基因型的待测玉米的株高低于或候选低于AB基因型的待测玉米； AB基因型的待测玉米的株高低于或候选低于BB基因型的待测玉米； X3)利用权利要求3或4所述的方法检测待测玉米的基因型， AA基因型的待测玉米的叶片数少于或候选少于BB基因型的待测玉米； AA基因型的待测玉米的叶片数少于或候选少于权利要求书 1/2 页 2 CN 107586881 A 2 AB基因型的待测玉米； AB基因型的待测玉米的叶片数少于或候选少于BB基因型的待测玉米。 6.权利要求1或2中所述玉米分子标记。 7.检测权利要求1或2所述玉米分子标记的物质，包括权利要求4中所述引物对M1。 8.。

8、下述1)、 2)、 3)、 4)或5)的应用： 1)检测权利要求1或2所述玉米分子标记的物质在玉米育种中的应用； 2)检测权利要求1或2所述玉米分子标记的物质在检测玉米开花期相关性状中的应用； 3)权利要求1或2所述玉米分子标记在玉米育种中的应用； 4)权利要求3或4所述的检测玉米基因型的方法在玉米育种中的应用； 5)权利要求5所述方法在玉米育种中的应用。 9.根据权利要求1、 2或8所述的应用，其特征在于：所述开花期相关性状为开花期、株高或叶片数。 10.玉米育种方法，按照权利要求3或4所述的方法检测玉米的基因型，选择AA、 AB或BB 基因型的玉米作为亲本进行育种。权利要求书。

9、 2/2 页 3 CN 107586881 A 3 玉米分子标记及其在检测玉米开花期相关性状中的应用技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域中，玉米分子标记及其在检测玉米开花期相关性状中的应用。背景技术 0002 开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要过程。当植物生长发育到一定时期，在合适的光照、温度、水分和营养条件下，植物叶片产生的成花素信号经维管束运输到茎尖分生组织，诱导相关成花基因的表达，进而分化出花原基，进一步发育形成花器官。开花期是作物重要的农艺性状之一，开花期的长短决定了作物生育期的长短，且在一定程度上制约着作物的地区及季节适应性。株高和。

10、叶片数作为开花期的相关性状在一定程度上反应了开花期的长短并且与作物的生物量、抗倒伏性和产量紧密相关。因此，选育和推广与当地生态环境相适应的具有适宜的开花期、株高和叶片数的作物品种一直是育种工作者的主要目标之一。玉米(Zea mays ssp.mays)是由约1万年前分布于墨西哥南部的大刍草(Zea mays ssp.parviglumis)驯化而来。虽然大刍草仅分布在墨西哥南部的较小区域内，但现代栽培玉米已经遍布世界各地，已成为世界上种植最广泛的作物之一。热带玉米对光周期敏感，只有在短日照低纬度地区才能正常开花结实，在长日照高纬度地区表现出不开花或延迟开花的特。

11、性，这极大地阻碍了优良种质资源的充分利用。相反，温带玉米则对光周期不敏感，可以在长日照高纬度地区正常开花结实。因此，培育和种植对光周期不敏感的品种是长日照高纬度地区扩大玉米种植范围和维持高产稳产的重要途径。 0003 插入缺失(InDel)标记是常用的基于DNA水平差异的分子标记之一，具体指的是两个亲本中的差异，相对一个亲本而言，另一个亲本的基因组某些位点中有一定数量的核苷酸插入或缺失，根据其插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物。分子标记具有数量大，检测不受环境条件、发育时期和表达调控等因素影响以及能提供完整丰富的遗传信息等优点，已被。

12、广泛应用于种质资源鉴定、群体遗传多样性分析、 QTL定位及基因克隆和分子标记辅助选择等方面。分子标记辅助选择是指如果目标基因与某个分子标记紧密连锁，那么通过对分子标记基因型的检测，就能获知目标基因的基因型，达到定向改良目标性状的目的。因此，能够借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，这就是分子标记辅助选择(MAS)。利用分子标记分析与目的基因紧密连锁的基因型，辅助回交选择，辅助系谱选择乃至全基因组选择，从而减轻连锁累赘，聚合有利基因，加快育种进程，提高选择效果。 0004 尽管根据玉米基因组已经开发了大量的分子标记，但对玉米分子标记的开发仍未达到饱和。

13、。鉴于玉米在世界粮食安全和农业可持续发展中的重要作用，开发与玉米开花期、株高和叶片数等性状紧密连锁的分子标记对于玉米分子育种、新品种的培育、种质资源的评价和栽培技术的创新具有重要的指导意义。发明内容 0005 本发明的目的是提供一种可用于鉴定玉米开花期相关性状的玉米分子标记，开花说明书 1/8 页 4 CN 107586881 A 4 期相关性状为开花期、株高和叶片数。 0006 本发明首先提供了玉米分子标记在检测或辅助检测玉米开花期相关性状中的应用； 0007 所述玉米分子标记为下述A1)或A2)或A3)： 0008 A1)序列表中序列1的第42-401位所示的DNA片。

14、段； 0009 A2)将A1)的DNA片段经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与 A1)限定的核苷酸序列具有90或90以上同一性的DNA片段； 0010 A3)包含A1)或A2)的DNA片段。 0011 这里使用的术语 “同一性” 指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比() 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。 0012 上述90或90以上同一性，可为95以上的同一性。 0013 上述应用中， A3)具体可为序列表中序列1或序列2所示的DNA片段。 0014 上述应用中，所述。

15、开花期相关性状可为开花期、株高或叶片数。 0015 本发明还提供了检测玉米基因型的方法，所述基因型为AA基因型、 AB基因型和BB 基因型；所述方法包括如下或： 0016 、检测待测玉米基因组DNA中对应于序列表中序列1的第42-401位的序列，如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测玉米为AA基因型；如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测玉米为BB基因型；如所述待测玉米基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测玉米为AB基因型； 0017 g1)含有序列表中序列1的第42。

16、-401位； 0018 g2)不含有序列表中序列1的第42-401位； 0019 、检测待测玉米基因组DNA中对应于序列表中序列1的DNA片段，如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述h1)的染色体，所述待测玉米为AA基因型；如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述h2)的染色体，所述待测玉米为BB基因型；如所述待测玉米基因组中两条染色体中一条为下述h1)的染色体，另一条为下述h2)的染色体，所述待测玉米为 AB基因型； 0020 h1)对应于序列表中序列1的序列为序列1； 0021 h2)对应于序列表中序列1的序列为序列2。 0022 上述方法中所述检测待测玉米基因组D。

17、NA中对应于序列表中序列1的DNA片段通过引物对M1对所述待测玉米的基因组DNA进行PCR扩增进行；所述M1由序列表中序列1的第 1-19位所示的单链DNA和与序列表中序列1的第482-501位互补的单链DNA组成。 0023 采用所述引物对M1检测所述待测玉米的基因型具体可包括如下L1)和L2)： 0024 L1)以所述待测玉米基因组DNA为模板，采用所述引物对M1进行PCR扩增得到PCR产物； 0025 L2)下述L21)或L22)： 0026 L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定玉米基因型： 0027 所述PCR产物含有序列1所示的DNA片段和序。

18、列2所示的DNA片段的所述待测玉米的说明书 2/8 页 5 CN 107586881 A 5 基因型为AB基因型；所述PCR产物含有序列2所示的DNA片段、不含序列1所示的DNA片段，所述待测玉米的基因型为BB基因型；所述PCR产物含有序列1所示的DNA片段、不含序列2所示的DNA片段，所述待测玉米的基因型为AA基因型； 0028 L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定玉米基因型： 0029 所述PCR产物含有501bp和141bp的DNA片段的所述待测玉米的基因型为AB基因型；所述PCR产物含有501bp的DNA片段且不含有141b。

19、p的DNA片段的所述待测玉米的基因型为AA 基因型；所述PCR产物不含有501bp的DNA片段且含有141bp的DNA片段的所述待测玉米的基因型为BB基因型。 0030 本发明还提供了检测玉米开花期相关性状的方法，所述开花期相关性状为开花期、株高或叶片数，所述方法包括下述X1)、 X2或X3)： 0031 X1)利用所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型， AA基因型的待测玉米的开花期短于或候选短于BB基因型的待测玉米； AA基因型的待测玉米的开花期短于或候选短于AB基因型的待测玉米； AB基因型的待测玉米的开花期短于或候选短于BB基因型的待测玉米； 0032 X2)利。

20、用所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型， AA基因型的待测玉米的株高低于或候选低于BB基因型的待测玉米； AA基因型的待测玉米的株高低于或候选低于AB基因型的待测玉米； AB基因型的待测玉米的株高低于或候选低于BB基因型的待测玉米； 0033 X3)利用所述检测玉米基因型的方法检测待测玉米的基因型， AA基因型的待测玉米的叶片数少于或候选少于BB基因型的待测玉米； AA基因型的待测玉米的叶片数少于或候选少于AB基因型的待测玉米； AB基因型的待测玉米的叶片数少于或候选少于BB基因型的待测玉米。 0034 本发明还提供了所述玉米分子标记。 0035 本发明还提供了检测所述玉米。

21、分子标记的物质，所述物质包括所述引物对M1。所述物质可由所述引物对M1和进行PCR扩增所需的物质组成，也仅可由所述引物对M1组成。 0036 本发明还提供了下述1)、 2)、 3)、 4)或5)的应用： 0037 1)检测所述玉米分子标记的物质在玉米育种中的应用； 0038 2)检测所述玉米分子标记的物质在检测玉米开花期相关性状中的应用； 0039 3)所述玉米分子标记在玉米育种中的应用； 0040 4)所述检测玉米基因型的方法在玉米育种中的应用； 0041 5)所述检测玉米开花期相关性状的方法在玉米育种中的应用。 0042 上述应用中，所述检测所述玉米分子标记的物质可为所述引物对M。

22、1，也可为其他的可以检测到所述分子标记的物质。 0043 上述应用中，所述开花期相关性状可为开花期、株高或叶片数。 0044 本发明还提供了玉米育种方法，按照所述检测玉米基因型的方法检测玉米的基因型，选择AA、 AB或BB基因型的玉米作为亲本进行育种。 0045 上述玉米育种方法中，在选择亲本进行育种时，可根据不同的目的选择不同基因型的玉米进行育种。说明书 3/8 页 6 CN 107586881 A 6 0046 本发明中，所述开花期具体可为从玉米播种到雄穗主雄一半散粉的天数。所述株高具体可为在玉米成熟期从地面到玉米最上叶叶环处的高度(cm)。所述叶片数具体可为。

23、玉米在整个生育期所产生的叶片数的总数。 0047 实验证明，两条染色体均含有序列表中序列1的第42-401位所示的DNA片段的AA基因型玉米的开花期、株高和叶片数少于两条染色体均不含有序列表中序列1的第42-401位所示的DNA片段的BB基因型玉米，与BB基因型玉米相比， AA基因型玉米的开花期减少3.6天，株高降低4.6cm，叶片数减少0.8片； AA基因型玉米的开花期、株高和叶片数少于AB基因型玉米(一条染色体含有序列表中序列1的第42-401位所示的DNA片段、一条不含序列表中序列1 的第42-401位所示的DNA片段的玉米)； AB基因型玉米的开花期、株高和叶片。

24、数少于BB基因型玉米。表明，本发明的玉米分子标记与开花期、株高和叶片数有关，可以用来鉴定玉米开花期相关性状。附图说明 0048 图1为基因型为AA、 BB和AB的玉米进行PCR鉴定的电泳图谱。 Marker为 D2000Marker，从下往上条带大小依次为100bp、 250bp、 500bp、 750bp、 1000bp和2000bp。 AA为基因型为AA的玉米结果。 BB为基因型为BB的玉米结果。 AB为基因型为AB的玉米结果。具体实施方式 0049 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下。

25、述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0050 下述实施例中的MR1480(Huang et al.， Identification and fine mapping of quantitative trait loci for the number of vascular bundle in maize stem， Journal of Integrative Plant Biology， January 2016， Volume 58， Issue 1， 8190)公众可从申请人处获得该。

26、生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用， MR1480为由玉米自交系W22与玉米野生祖先种大刍草(Zea mays ssp.parviglumis)通过杂交、回交和自交衍生得到的家系。 0051 其中，玉米自交系W22(Huang et al.， Identification and fine mapping of quantitative trait loci for the number of vascular bundle in maize stem， Journal of Integrative Plant Biology， January 2。

27、016， Volume 58， Issue 1， 8190)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。 0052 实施例1、玉米分子标记可以用来检测玉米开花期相关性状 0053 本实施例提供的玉米分子标记为序列表中序列1的第42-401位所示的DNA片段。 0054 根据玉米基因组中玉米分子标记的上下游设计引物对M1，引物对M1由序列表中序列1的第1-19位所示的单链DNA和与序列表中序列1的第482-501位互补的单链DNA组成。 0055 利用引物对M1对不同玉米的基因组DNA进行PCR扩增， PCR产物共有三种，第一种。

28、PCR产物的序列为序列1，第二种PCR产物的序列为序列2，第三种PCR产物的序列既有序列1 又有序列2。根据PCR产物序列的不同，将玉米分为不同的基因型： PCR产物序列为序列1的玉说明书 4/8 页 7 CN 107586881 A 7 米为AA基因型玉米， PCR产物序列为序列2的玉米为BB基因型玉米， PCR产物序列为序列1和序列2的玉米为AB基因型玉米。 0056 将MR1480连续自交得到F4代，在长日照条件下种植F4代玉米材料，每种材料种植5 行，隔行种植，行距50cm，株距25cm。施肥、灌溉、除草、打药等田间管理措施均按照当地大田管理的传统方式，。

29、并保证对所有植株田间管理的一致性。调查开花期相关性状。 0057 按照如下方法检测各玉米的基因型：提取玉米基因组DNA，利用引物对M1进行PCR 扩增，将得到的PCR产物进行测序，根据上述玉米基因型的分型方法确定玉米基因型， PCR扩增的反应体系与反应条件如下： 0058 PCR扩增的反应体系：玉米基因组DNA模板1 l(100ng/ l)， M1的正向引物0.5 l (10pmol/ l)， M1的反向引物0.5 l(10pmol/ l)， 2Taq PCR StarMix with LoadingDye (GenStar康润生物公司)5 l，超纯水3 l。总反应体系为1。

30、0 l。 0059 PCR扩增的反应条件： 9510min， 9545s， 5745s， 7240s，从- 循环35次， 7210min， 4保存。 0060 各基因型玉米的基因组DNA进行PCR扩增后进行电泳的图谱见图1。 0061 调查各基因型玉米的开花期相关性状，开花期相关性状为开花期、株高和叶片数，开花期是指从玉米播种到雄穗主雄一半散粉的天数，株高具体是指在玉米成熟期从地面到玉米最上叶叶环处的高度(cm)，叶片数具体是指玉米在整个生育期所产生的叶片数的总数。开花期、株高和叶片数分别见表1、 2和3。 0062 表1、不同玉米基因型的开花期(天) 说明书 5/8 页。

31、 8 CN 107586881 A 8 0063 0064 0065 表2、不同玉米基因型的株高(cm) 说明书 6/8 页 9 CN 107586881 A 9 0066 0067 0068 表3、不同玉米基因型的叶片数(片) 说明书 7/8 页 10 CN 107586881 A 10 0069 0070 0071 结果显示， AA基因型玉米的开花期、株高和叶片数均显著少于BB基因型玉米，与BB 基因型玉米相比， AA基因型玉米的开花期减少3.6天，株高降低4.6cm，叶片数减少0.8片； AA 基因型玉米的开花期、株高和叶片数均少于AB基因型玉米； AB基因型玉米的开花期、。

32、株高和叶片数均少于BB基因型玉米。说明书 8/8 页 11 CN 107586881 A 11 中国农业大学玉米分子标记及其在检测玉米开花期相关性状中的应用 2 PatentIn version 3.5 1 501 DNA 玉米 1 accgggagat tttgtggacg cggctcagac agacagggga ataagactaa ccgcagcgca 60 accccctacg cagccccctc cccttgcatg cggcgcgtag ggggcaccct atagccgcag 120 cggtgccccc tacagcgccc cctacgtgtc ggtcccc。

33、ttc tctctccccc cagatttagc 180 gtgtcactgt tcatcaccct taacactgtg ctgtggatcc acgagtaatt gttagtagat 240 aaaaaattga tagttggtat agaaaatgat attttatagt ggtagtgggg tataggggga 300 gtatttaggg gaaccgctgc gggagatgaa aaaatagggg agaaaatagg gggaaaagtg 360 atatagggaa aaaaatttag gggtaacggt tgcggatagc ctaaaggatc gggga。

34、tggct 420 ggctgggctg gcttcggcgc tattgcagac agttagtggt acagaaattc gtggagctaa 480 gcgtctcgat tgacgtacca a 501 2 141 DNA 玉米 2 accgggagat tttgtggacg cggctcagac agacagggga ataaaggatc ggggatggct 60 ggctgggctg gcttcggcgc tattgcagac agttagtggt acagaaattc gtggagctaa 120 gcgtctcgat tgacgtacca a 141 序列表 1/1 页 12 CN 107586881 A 12 图1 说明书附图 1/1 页 13 CN 107586881 A 13 。